ADV FUNCT MATER丨弗林蛋白酶引导细胞内金纳米颗粒聚集用于肿瘤光热治疗

作者：高倩倩

光热疗法（PTT），作为一种的癌症治疗的新兴技术，具有微创，选择性好，准确性高的优点。PTT的工作原理是光热剂（PTA）在激光照射下产生热量杀死癌细胞。理想的PTA应具有以下特点：在近红外（NIR）区域具有强吸收性，高的光热转换效率，强大的光稳定性和出色的生物相容性等。当前的PTA主要有无机材料，聚合物材料和小型有机染料。但是，所有这些PTA都存在着一些缺陷。尽管无机纳米材料面临着长期安全性的挑战，但它们出色的优点（如高的光热转化效率，易于合成和修饰以及多功能性）使其仍在报告的PTA中脱颖而出。其中金纳米结构具有低毒性，良好的生物相容性，化学惰性和可调节的表面等离子共振效应的优点。对于金纳米颗粒而言直径大于50nm的金纳米颗粒具有很强的NIR吸收（这是PTT所必需的），直径小于8nm的纳米粒子具有更长的血液停留时间和较短的生物学半衰期，更适合体内应用。因此肿瘤相关酶诱导直径小于8nm的金纳米粒子（AuNP）的聚集将会显著地提高传统PTA AuNP的PTT效率。

近日，安徽师范大学王广凤教授和东南大学梁高林教授在利用金纳米颗粒实现光热治疗癌症方面的研究取得重要进展，其相关成果发表在《ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS》上。研究综合利用弗林蛋白酶优先裂解Arg-X-Lys / Arg-Arg↓X肽及生物相容性的2-氰基苯并噻唑-半胱氨酸（CBT-Cys）缩合反应的特点，设计了弗林蛋白酶响应性金纳米颗粒平台（AuNP@1）,用于体内外的有效PTT癌症治疗。在被弗林蛋白酶高表达的癌细胞内化后，AuNP@1被谷胱甘肽还原二硫键，暴露出弗林蛋白酶的切割位点，从而切掉AcRVRR，剩余在金纳米颗粒上的2-氰基苯并噻唑-半胱氨酸（CBT-Cys）进行短暂的缩合反应，从而在AuNP@1s之间产生1-二聚体，使得AuNP@1s交联形成AuNP的聚集体。实验结果表明，AuNP聚集体的形成可以显著增强其光热性能。

机理图：细胞内furin诱导的CBT-Cys缩合反应示意图。当AuNP@1被癌细胞内化后，细胞内还原性的谷胱甘肽（GSH）将会还原二硫键并在furin的作用下使得AcRVRR肽序列离去，以暴露Cys的1,2-氨基硫醇基团。随后，CBT-Cys的缩合反应启动产生二聚体结构与AuNP@1交联并诱导AuNP在癌细胞的高尔基体附近聚集。此外，使用AC-Arg-Lys-Cys(StBu)-Arg-Val-CBT(1-Scr)来修饰AuNP从而产生AuNP@1-Scr，发现其只能被还原而没有被弗林切割，所以不可发生CBT-Cys缩合反应。AuNP的聚集不仅可以提高AuNP的近红外的吸收度，而且延长了AuNP在癌细胞中的滞留时间，最终在808 nm的激光照射下诱导癌细胞死亡。

图1.A）200 μg ml-1的AuNP@1在37 ℃下用1mM的GSH处理2 h（左）或用1mM的GSH处理2 h，然后在37 ℃下用1μM U-1的furin处理8 h的透射电子显微图（右）。B) 200 μg ml-1的AuNP@1-Scr在37 ℃下用1mM的GSH处理2 h（左）或用1mM的GSH处理2 h，然后在37 ℃下用1μM U-1的furin处理8 h的透射电子显微图（右）。C）200 μg ml-1的AuNP（黑色）的可见-近红外吸收光谱，200 μg ml-1的AuNP@1（红色）和200 μg ml-1的AuNP@1-Scr（蓝色）用1mM的GSH处理2 h，然后在37 ℃下用1μM U-1的furin处理8 h的可见-近红外吸收光谱。D) AuNP、AuNP@1、AuNP@1-Scr、PBS的温度变化曲线。E）在808 nm的近红外激光（2 W cm-2）照射5 min后，用1mM的GSH处理2 h，然后在37 ℃下用1μM U-1的furin处理8 h的200 μg m0l-1的AuNP@1（红色）和200 μg/ml的AuNP@1-Scr（品红色）、200 μg ml-1的AuNP（橙色）和PBS（黑色）的红外热成像图。

图2 A)MDA-MB-468细胞在37 ℃的条件下用200 μg ml-1的AuNP@1孵育6 h的低放大倍率的透射电子显微图。B)图A中白色矩形区域的高放大倍率的透射电子显微图。C) MDA-MB-468细胞在不同浓度的AuNP@1或AuNP@1-Scr下孵育6 h后的细胞生存能力对比，在去除纳米粒子后，用808 nm，2W cm-2的激光照射5 min，进行12 h的孵育。D) MDA-MB-468细胞的钙素AM/PI活死细胞染色。这些细胞用200 μg ml-1的AuNP@1或200 μg ml-1的AuNP@1-Scr在达尔伯克改良伊格尔培养基孵育6 h，洗涤以除去细胞外纳米颗粒，用808 nm，2W cm-2的激光照射5 min后，再孵育12h，并用钙黄绿素AM和PI染色。活细胞：绿色，死细胞：红色。

图3 A) AuNP@1、AuNP@1-Scr和PBS随时间变化的红外热成像图。B)分别注射分散在PBS中的50 μL AuNP@1（4 mg mL-1）、分散在PBS中的50 μL AuNP@1-Scr（4 mg mL-1）和50 μL的PBS,反应8 h后，用808 nm，2W cm-2的激光照射MDA-MB-468荷瘤小鼠的肿瘤部位5 min内温度的变化。C)注射一剂各种试剂后的MDA-MB-468荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线。D) MDA-MB-468荷瘤小鼠的肿瘤重量。E) MDA-MB-468荷瘤小鼠在18天观察后死亡的伊红染色图。F) MDA-MB-468荷瘤小鼠在注射不同试剂后的生长曲线，说明该材料无没有细胞毒性。

总之，本文通过利用内在酶促进furin的优势，在生物相容性CBT-Cys缩合反应的基础上，合理地开发了一种以furin为诱导的细胞内金纳米粒子聚集的策略，并设计了一个应用于有效肿瘤细胞光热治疗的弗林蛋白酶响应性金纳米颗粒平台（AuNP@1）。实验结果表明，AuNP聚集体的形成可以大大增强其光热特性，此外，AuNP@1表现出极好的生物相容性，可以预见，AuNP@1在不久的将来可用于弗林蛋白酶相关癌症的临床PTT。

Jihua Chen, Yinchu Ma, Wei Du. Furin-Instructed Intracellular Gold Nanoparticle Aggregation for Tumor Photothermal Therapy ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS 2020 DOI: 10.1002/adfm.202001566