NAR丨C2′-氟代核酸在生理盐条件下形成左手螺旋

大家好，今天为大家分享的文献是2024年6月发表于Nucleic Acids Research上的Formation of left-handed helices by C2′-fluorinated nucleic acids under physiological salt conditions。

作者介绍

本文的通讯作者为来自巴塞罗那生物医学研究所的Modesto Orozco教授，其主要从事非经典核酸的结构、大分子的动力学特性及蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质识别方面的研究。

研究背景

左旋Z-DNA已被证明在多种生物学过程中发挥重要作用，包括基因表达调节、核小体定位以及与DNA损伤和修复相关的遗传不稳定性。因此，Z-DNA已成为重要的治疗靶标。尽管Z-DNA已确定具有生物学相关性，但其仅在高离子强度下（即 3 ~ 4 M NaCl）或某些溶剂中于体外稳定存在。在这些条件下，Z型有利序列（嘧啶/嘌呤重复序列）的嘌呤以顺式存在，从而促使Z-DNA进入其特有的锯齿形结构。在生理条件下Z-DNA的形成依赖于配体的结合和核苷修饰。本文报道了市售的2′F-araC (afC)和2′F-riboG (rfG)（图1）修饰核苷能够稳定与ADAR1 p150的Zα结构域结合的Z-DNA序列，并保留其结合能力。

图1 2′F-araC和2′F-riboG的结构

研究结果

表1 (CG)₃的序列设计

首先，作者通过CD和¹⁹F核磁共振光谱分析了一系列afC取代的 (CG)₃ 寡核苷酸序列（表1）。通过监测CD 光谱 295 nm处负峰的出现和强度或 200 nm处负峰的强度，来检测Z-DNA的形成。增加 afC 取代个数，作者观察到295 nm处负峰的出现和强度变化发生在较低的盐浓度下（图2），这表明afC取代个数的增加会逐渐增强Z-DNA的稳定性。盐诱导Z-DNA过渡的中点可以从负峰的强度来估计，CTRL约为2.6 M NaCl，aFC1约为2.0 M NaCl，aFC2约为1.6 M NaCl，aFC3约为1.0 M NaCl。

图2 aFC3和rFG3取代的 (CG)₃ 序列在不同NaCl浓度下的CD光谱

如图所示，¹⁹F核磁共振光谱的结果（图3和图4）与CD光谱的结果非常一致。利用不同盐浓度下的¹⁹F信号，可以轻易识别B-DNA和Z-DNA，其中B-DNA从-116到-120 ppm，Z-DNA从-124到-126 ppm（图3）；在接近熔解温度时，B-DNA和Z-DNA的信号变宽并逐渐消失（图4）；在55-65°C，单链DNA的尖锐信号出现在狭窄的-120到-121 ppm光谱范围内，与B-DNA和Z-DNA的信号完全区分开来，这表明afC是通过核磁共振检测DNA构象状态的绝佳探针。

图3（A）0 M和（B）2 M NaCl溶液中的aFC1、aFC2和aFC3的¹⁹F-NMR光谱。（C）0 M和（D）1 M NaCl溶液中 aFC3rFG1、aFC3rFG2和aFC3rFG3的¹⁹F-NMR光谱。

作者还通过替换CTRL序列的所有dG残基来探索rfG的影响，如序列rFG3（图2）。与afC替换一样，来自B-DNA和Z-DNA中的¹⁹F信号出现在了不同的区域，然而，它们向相反的方向移动： Z-DNA中的¹⁹F信号处于下游区域，而B-DNA处于上游区域（图4B），这可能是由于N-糖苷键的顺式/反式变化。

图4 不同温度下（A）aFC3、（B）rFG3和（C）aFC3rFG3的¹⁹F-NMR光谱。

考虑到afC和rfG促进Z-DNA形成的倾向，作者进一步研究了同时存在afC和rfG的序列（表1）。¹⁹F核磁共振光谱中的信号数量表明aFC3rFG2和aFC3rFG3存在单一组成（图3C，3D），而aFC3rFG1仅在低盐条件下观察到次要成分。¹⁹F核磁共振光谱信号的位移以及CD光谱中200 nm和295 nm的负峰均确认了Z-DNA的形成（图5）。此外，在2D NOESY光谱中观察到非常强的H8-H1'信号，表明所有嘌呤（rfG和dG）都处于顺式构象状态，确认了向Z-DNA的完全转变（图5），证明了同一链中afC和rfG促进Z-DNA形成的协同效应。¹⁹F核磁共振光谱表明，在10 mM磷酸钠pH中性缓冲液中，Z-DNA是aFC3rFG2和aFC3rFG3序列的唯一形式（图3C）；并且aFC3rFG3序列的信号在接近熔解温度下显著变宽（图4C）；有趣的是，在任何温度下都没有观察到B-DNA信号。

图5 不同NaCl浓度下（A）rFG3、（B）aFC3rFG1、（C）aFC3rFG2和（D）aFC3rFG3的CD光谱。aFC3rFG1（E）和aFC3rFG2（F）的2D NOESY光谱。

2D光谱（图4D-F）显示Z-DNA是aFC3rFG3存在的唯一形式，而aFC3和rFG3中两种构象共存。尽管aFC3和rFG3中B-DNA和Z-DNA并存，但良好的信号分散可以对两种构象进行完全区分。B-DNA可以按照右手螺旋的标准路径进行辨认（图4D、4E），Z-DNA的¹H共振可以通过顺式鸟嘌呤的H1′-H8 强NOE信号来确认。为了深入了解2′F修饰对Z-DNA的稳定，作者通过对¹H和¹⁹F核磁共振光谱的完整分析，在低盐条件下对序列aFC3、rFG3和aFC3rFG3进行了结构测定。在¹⁹F-¹H HOESY异核光谱（图6C）中，作者观察到aFC3rFG3的afC残基的两种奇特信号：2′F-H6的HOE信号和2′F与其5′端邻位鸟嘌呤的氨基质子之间的HOE信号。

图6 （A）aFC3、（B）rFG3和（C）aFC3rFG3的¹⁹F-¹H HOESY光谱。

aFC3rFG3的Z形结构如下（图7），作者对结构分析发现，aFC3rFG3符合 Z-DNA 的一般特征并且其小沟尺寸与标准Z-DNA相似。rfG氟原子主要暴露在表面，而afC氟原子则指向狭窄的小沟。在aFC3rFG3中，氟非常接近其5′端相邻rfGs的氨基（图7B）。这与观察到的HOE信号完全一致（图6C）。

图7  aFC3rFG3的结构。

为了更好地了解这些结构在B构象和Z构象的相对稳定性，作者进行了分子动力学模拟。采样结构的RMSD显示，aFC3和rFG3的B构象和Z构象在整个模拟过程中是稳定的，而aFC3rFG3迅速偏离B构象，保持在Z构象附近。为了证明短序列中获得的结果具有普遍性，作者随后对四个20 bp双链进行了模拟，即 (dCdG)₁₀、(afCdG)₁₀、(dCrfG)₁₀和(afCrfG)₁₀，分别表示为CTRL20、aFC10、rFG10和aFC10rFG10（图8）。与在6 bp双链中的发现一致，对照DNA始终表现出对B构象的偏好，而aFC10rFG10在B构象上不稳定且非常接近规范的Z构象。

图8 (dCdG)₁₀、(afCdG)₁₀、(dCrfG)₁₀和(afCrfG)₁₀ 序列的150 ns MD轨迹的代表性结构。

由于Z-DNA可以与ADAR1 p150的Zα结构域进行特异性结合，作者使用具有等额浓度Zα（图9A）和2倍Zα浓度（图9B）的EMSA试验来研究CTRL、aFC3、rFG3和aFC3rFG3与Zα结构域的相对结合亲和力。实验结果表明，与对照组相比，氟化双链对蛋白质具有更高的相对结合亲和力，表明氟代后序列对Z构象的采用倾向更高。

图9 CTRL、aFC3、rFG3和aFC3rFG3双链的EMSA实验

研究总结

（1）发现了两个最小修饰的核苷（afG和rfC）在生理盐浓度下可以诱导Z-DNA的形成。

（2）aFC3rFG3形成单一Z-DNA构象，并与ADAR1 p150的Zα结构域特异性结合。

（3）对核苷的氟化修饰使我们得可以利用¹⁹F核磁共振光谱监测B - Z跃迁，从而筛选新的Z-DNA结合蛋白，发现 Zα 以外的对Z-DNA具有特异性的结构域。

（4）在生理条件下稳定的Z-DNA可以应用在临床治疗的研究中，例如提高ADAR1编辑酶的靶向性。

原文链接

El-Khoury R, Cabrero C, Movilla S, et al. Formation of left-handed helices by C2'-fluorinated nucleic acids under physiological salt conditions. Nucleic Acids Res. 2024;52(13):7414-7428. doi:10.1093/nar/gkae508