韩 达 课 题 组

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NAR丨C2′-氟代核酸在生理盐条件下形成左手螺旋

 

大家好,今天为大家分享的文献是20246月发表于Nucleic Acids Research上的Formation of left-handed helices by C2′-fluorinated nucleic acids under physiological salt conditions

 

 

作者介绍

本文的通讯作者为来自巴塞罗那生物医学研究所的Modesto Orozco教授,其主要从事非经典核酸的结构、大分子的动力学特性及蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质识别方面的研究。

 

研究背景

左旋Z-DNA已被证明在多种生物学过程中发挥重要作用,包括基因表达调节、核小体定位以及与DNA损伤和修复相关的遗传不稳定性。因此,Z-DNA已成为重要的治疗靶标。尽管Z-DNA已确定具有生物学相关性,但仅在高离子强度下(即 3 ~ 4 M NaCl)或某些溶剂中于体外稳定存在。在这些条件下,Z型有利序列(嘧啶/嘌呤重复序列)的嘌呤以顺式存在,从而促使Z-DNA进入其特有的锯齿形结构。在生理条件Z-DNA的形成依赖于配体的结合和核苷修饰。本文报道了市售的2′F-araC (afC)2F-riboG (rfG)1修饰核苷能够稳定与ADAR1 p150结构域结合的Z-DNA序列,并保留其结合能力

 

1 2′F-araC2F-riboG的结构

 

研究结果

1 (CG)3的序列设计

首先,作者通过CD19F核磁共振光谱分析了一系列afC取代的 (CG)3 寡核苷酸序列(1)。通过监测CD 光谱 295 nm负峰的出现和强度或 200 nm负峰的强度,检测Z-DNA形成。增加 afC 取代个数作者观察到295 nm负峰出现和强度变化发生在较低的盐浓度下(2),这表明afC取代个数的增加会逐渐增强Z-DNA稳定性。盐诱导Z-DNA过渡的中点可以从负峰的强度来估计,CTRL约为2.6 M NaClaFC1约为2.0 M NaClaFC2约为1.6 M NaClaFC3约为1.0 M NaCl

 

2 aFC3rFG3取代的 (CG)3 序列在不同NaCl浓度下的CD光谱

如图所示,19F核磁共振光谱的结果(34)与CD光谱的结果非常一致。利用不同盐浓度下的19F信号,可以轻易识别B-DNAZ-DNA,其中B-DNA-116-120 ppmZ-DNA-124-126 ppm3;在接近熔解温度时B-DNAZ-DNA信号变宽并逐渐消失(4);在55-65°C单链DNA的尖锐信号出现在狭窄的-120-121 ppm光谱范围内,与B-DNAZ-DNA信号完全区分开来,这表明afC是通过核磁共振检测DNA构象状态的绝佳探针

 

 

 

3A0 M和(B2 M NaCl溶液中aFC1aFC2aFC319F-NMR光谱。(C0 M和(D1 M NaCl溶液中 aFC3rFG1aFC3rFG2aFC3rFG319F-NMR光谱。

 

作者还通过替换CTRL序列的所有dG残基来探索rfG的影响,如序列rFG32)。与afC替换一样,来自B-DNAZ-DNA中的19F信号出现在了不同的区域,然而,它们向相反的方向移动: Z-DNA中的19F信号处于下游区域,而B-DNA处于上游区域4B这可能是由于N-糖苷键的顺式/反式变化。

 

4 不同温度下(AaFC3、(BrFG3和(CaFC3rFG319F-NMR光谱。

 

考虑到afCrfG促进Z-DNA形成的倾向,作者进一步研究了同时存在afCrfG的序列(1)。19F核磁共振光谱中的信号数量表明aFC3rFG2aFC3rFG3存在单一组成3C3D),aFC3rFG1仅在低盐条件下观察到次要成分。19F核磁共振光谱信号的位移以及CD光谱中200 nm295 nm负峰均确认了Z-DNA形成(5)。此外,在2D NOESY光谱中观察到非常强的H8-H1'信号,表明所有嘌呤(rfGdG)都处于顺式构象状态,确认了向Z-DNA的完全转变5),证明了同一链中afCrfG促进Z-DNA形成的协同效应。19F核磁共振光谱表明,10 mM磷酸钠pH中性缓冲液中,Z-DNAaFC3rFG2aFC3rFG3序列唯一形式3C);并且aFC3rFG3序列的信号在接近熔解温度下显著变宽4C);有趣的是,在任何温度下都没有观察到B-DNA信号。

 

5 不同NaCl浓度ArFG3、(BaFC3rFG1、(CaFC3rFG2和(DaFC3rFG3CD光谱。aFC3rFG1E)和aFC3rFG2F)的2D NOESY光谱

 

2D光谱(4D-F)显示Z-DNAaFC3rFG3存在的唯一形式,而aFC3rFG3两种构象共存。尽管aFC3rFG3B-DNAZ-DNA并存,但良好的信号分散可以对两种构象进行完全区分B-DNA可以按照右手螺旋的标准路径进行辨认(4D4EZ-DNA1H共振可以通过顺式鸟嘌呤的H1′-H8 NOE信号确认为了深入了解2′F修饰对Z-DNA的稳定,作者通过对1H19F核磁共振光谱的完整分析,在低盐条件下对序列aFC3rFG3aFC3rFG3进行了结构测定。在19F-1H HOESY异核光谱(6C)中,作者观察到aFC3rFG3afC残基的两种奇特信号:2′F-H6HOE信号2′F与其5′鸟嘌呤的氨基质子之间HOE信号。

 

 

6AaFC3、(BrFG3和(CaFC3rFG319F-1H HOESY光谱。

 

aFC3rFG3Z形结构如下(7),作者对结构分析发现,aFC3rFG3符合 Z-DNA 的一般特征并且其小沟尺寸与标准Z-DNA相似。rfG氟原子主要暴露在表面,而afC氟原子则指向狭窄的小沟。在aFC3rFG3中,氟非常接近其5′端相邻rfGs的氨基(7B)。这与观察到的HOE信号完全一致(6C)。

7  aFC3rFG3的结构。

 

为了更好地了解这些结构在B构象Z构象的相对稳定性,作者进行了分子动力学模拟。采样结构的RMSD显示,aFC3rFG3B构象Z构象在整个模拟过程中是稳定的,aFC3rFG3迅速偏离B构象,保持在Z构象附近。为了证明短序列中获得的结果具有普遍性作者随后对四个20 bp进行了模拟,即 (dCdG)10(afCdG)10(dCrfG)10(afCrfG)10,分别表示为CTRL20aFC10rFG10aFC10rFG108)。与在6 bp双链中的发现一致,对照DNA始终表现出对B构象的偏好,而aFC10rFG10B构象上不稳定非常接近规范的Z构象。

8 (dCdG)10(afCdG)10(dCrfG)10(afCrfG)10 序列的150 ns MD轨迹的代表性结构。

 

由于Z-DNA可以ADAR1 p150Zα结构域进行特异性结合,作者使用具有等额浓度Zα9A2Zα浓度(9B)的EMSA试验来研究CTRLaFC3rFG3aFC3rFG3Zα结构域的相对结合亲和力。实验结果表明,对照组相比氟化双对蛋白质具有更高的相对结合亲和力,表明氟代后序列对Z构象的采用倾向更高。

9 CTRLaFC3rFG3aFC3rFG3双链的EMSA实验

 

研究总结

1发现两个最小修饰的核苷(afGrfC)在生理盐浓度下可以诱导Z-DNA的形成。

2aFC3rFG3形成单Z-DNA构象,并与ADAR1 p150结构域特异性结合。

3对核苷的氟化修饰使我们得可以利用19F核磁共振光谱监测B - Z跃迁,从而筛选新的Z-DNA结合蛋白,发现 以外Z-DNA具有特异性的结构域

4在生理条件下稳定的Z-DNA可以应用在临床治疗的研究中,例如提高ADAR1编辑酶的靶向性。

 

原文链接

El-Khoury R, Cabrero C, Movilla S, et al. Formation of left-handed helices by C2'-fluorinated nucleic acids under physiological salt conditions. Nucleic Acids Res. 2024;52(13):7414-7428. doi:10.1093/nar/gkae508

 

2024年8月19日 12:49
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