NAR丨C2′-氟代核酸在生理盐条件下形成左手螺旋
大家好,今天为大家分享的文献是2024年6月发表于Nucleic Acids Research上的Formation of left-handed helices by C2′-fluorinated nucleic acids under physiological salt conditions。
作者介绍
本文的通讯作者为来自巴塞罗那生物医学研究所的Modesto Orozco教授,其主要从事非经典核酸的结构、大分子的动力学特性及蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质识别方面的研究。
研究背景
左旋Z-DNA已被证明在多种生物学过程中发挥重要作用,包括基因表达调节、核小体定位以及与DNA损伤和修复相关的遗传不稳定性。因此,Z-DNA已成为重要的治疗靶标。尽管Z-DNA已确定具有生物学相关性,但其仅在高离子强度下(即 3 ~ 4 M NaCl)或某些溶剂中于体外稳定存在。在这些条件下,Z型有利序列(嘧啶/嘌呤重复序列)的嘌呤以顺式存在,从而促使Z-DNA进入其特有的锯齿形结构。在生理条件下Z-DNA的形成依赖于配体的结合和核苷修饰。本文报道了市售的2′F-araC (afC)和2′F-riboG (rfG)(图1)修饰核苷能够稳定与ADAR1 p150的Zα结构域结合的Z-DNA序列,并保留其结合能力。
图1 2′F-araC和2′F-riboG的结构
研究结果
表1 (CG)3的序列设计
首先,作者通过CD和19F核磁共振光谱分析了一系列afC取代的 (CG)3 寡核苷酸序列(表1)。通过监测CD 光谱 295 nm处负峰的出现和强度或 200 nm处负峰的强度,来检测Z-DNA的形成。增加 afC 取代个数,作者观察到295 nm处负峰的出现和强度变化发生在较低的盐浓度下(图2),这表明afC取代个数的增加会逐渐增强Z-DNA的稳定性。盐诱导Z-DNA过渡的中点可以从负峰的强度来估计,CTRL约为2.6 M NaCl,aFC1约为2.0 M NaCl,aFC2约为1.6 M NaCl,aFC3约为1.0 M NaCl。
图2 aFC3和rFG3取代的 (CG)3 序列在不同NaCl浓度下的CD光谱
如图所示,19F核磁共振光谱的结果(图3和图4)与CD光谱的结果非常一致。利用不同盐浓度下的19F信号,可以轻易识别B-DNA和Z-DNA,其中B-DNA从-116到-120 ppm,Z-DNA从-124到-126 ppm(图3);在接近熔解温度时,B-DNA和Z-DNA的信号变宽并逐渐消失(图4);在55-65°C,单链DNA的尖锐信号出现在狭窄的-120到-121 ppm光谱范围内,与B-DNA和Z-DNA的信号完全区分开来,这表明afC是通过核磁共振检测DNA构象状态的绝佳探针。
图3(A)0 M和(B)2 M NaCl溶液中的aFC1、aFC2和aFC3的19F-NMR光谱。(C)0 M和(D)1 M NaCl溶液中 aFC3rFG1、aFC3rFG2和aFC3rFG3的19F-NMR光谱。
作者还通过替换CTRL序列的所有dG残基来探索rfG的影响,如序列rFG3(图2)。与afC替换一样,来自B-DNA和Z-DNA中的19F信号出现在了不同的区域,然而,它们向相反的方向移动: Z-DNA中的19F信号处于下游区域,而B-DNA处于上游区域(图4B),这可能是由于N-糖苷键的顺式/反式变化。
图4 不同温度下(A)aFC3、(B)rFG3和(C)aFC3rFG3的19F-NMR光谱。
考虑到afC和rfG促进Z-DNA形成的倾向,作者进一步研究了同时存在afC和rfG的序列(表1)。19F核磁共振光谱中的信号数量表明aFC3rFG2和aFC3rFG3存在单一组成(图3C,3D),而aFC3rFG1仅在低盐条件下观察到次要成分。19F核磁共振光谱信号的位移以及CD光谱中200 nm和295 nm的负峰均确认了Z-DNA的形成(图5)。此外,在2D NOESY光谱中观察到非常强的H8-H1'信号,表明所有嘌呤(rfG和dG)都处于顺式构象状态,确认了向Z-DNA的完全转变(图5),证明了同一链中afC和rfG促进Z-DNA形成的协同效应。19F核磁共振光谱表明,在10 mM磷酸钠pH中性缓冲液中,Z-DNA是aFC3rFG2和aFC3rFG3序列的唯一形式(图3C);并且aFC3rFG3序列的信号在接近熔解温度下显著变宽(图4C);有趣的是,在任何温度下都没有观察到B-DNA信号。
图5 不同NaCl浓度下(A)rFG3、(B)aFC3rFG1、(C)aFC3rFG2和(D)aFC3rFG3的CD光谱。aFC3rFG1(E)和aFC3rFG2(F)的2D NOESY光谱。
2D光谱(图4D-F)显示Z-DNA是aFC3rFG3存在的唯一形式,而aFC3和rFG3中两种构象共存。尽管aFC3和rFG3中B-DNA和Z-DNA并存,但良好的信号分散可以对两种构象进行完全区分。B-DNA可以按照右手螺旋的标准路径进行辨认(图4D、4E),Z-DNA的1H共振可以通过顺式鸟嘌呤的H1′-H8 强NOE信号来确认。为了深入了解2′F修饰对Z-DNA的稳定,作者通过对1H和19F核磁共振光谱的完整分析,在低盐条件下对序列aFC3、rFG3和aFC3rFG3进行了结构测定。在19F-1H HOESY异核光谱(图6C)中,作者观察到aFC3rFG3的afC残基的两种奇特信号:2′F-H6的HOE信号和2′F与其5′端邻位鸟嘌呤的氨基质子之间的HOE信号。
图6 (A)aFC3、(B)rFG3和(C)aFC3rFG3的19F-1H HOESY光谱。
aFC3rFG3的Z形结构如下(图7),作者对结构分析发现,aFC3rFG3符合 Z-DNA 的一般特征并且其小沟尺寸与标准Z-DNA相似。rfG氟原子主要暴露在表面,而afC氟原子则指向狭窄的小沟。在aFC3rFG3中,氟非常接近其5′端相邻rfGs的氨基(图7B)。这与观察到的HOE信号完全一致(图6C)。
图7 aFC3rFG3的结构。
为了更好地了解这些结构在B构象和Z构象的相对稳定性,作者进行了分子动力学模拟。采样结构的RMSD显示,aFC3和rFG3的B构象和Z构象在整个模拟过程中是稳定的,而aFC3rFG3迅速偏离B构象,保持在Z构象附近。为了证明短序列中获得的结果具有普遍性,作者随后对四个20 bp双链进行了模拟,即 (dCdG)10、(afCdG)10、(dCrfG)10和(afCrfG)10,分别表示为CTRL20、aFC10、rFG10和aFC10rFG10(图8)。与在6 bp双链中的发现一致,对照DNA始终表现出对B构象的偏好,而aFC10rFG10在B构象上不稳定且非常接近规范的Z构象。
图8 (dCdG)10、(afCdG)10、(dCrfG)10和(afCrfG)10 序列的150 ns MD轨迹的代表性结构。
由于Z-DNA可以与ADAR1 p150的Zα结构域进行特异性结合,作者使用具有等额浓度Zα(图9A)和2倍Zα浓度(图9B)的EMSA试验来研究CTRL、aFC3、rFG3和aFC3rFG3与Zα结构域的相对结合亲和力。实验结果表明,与对照组相比,氟化双链对蛋白质具有更高的相对结合亲和力,表明氟代后序列对Z构象的采用倾向更高。
图9 CTRL、aFC3、rFG3和aFC3rFG3双链的EMSA实验
研究总结
(1)发现了两个最小修饰的核苷(afG和rfC)在生理盐浓度下可以诱导Z-DNA的形成。
(2)aFC3rFG3形成单一Z-DNA构象,并与ADAR1 p150的Zα结构域特异性结合。
(3)对核苷的氟化修饰使我们得可以利用19F核磁共振光谱监测B - Z跃迁,从而筛选新的Z-DNA结合蛋白,发现 Zα 以外的对Z-DNA具有特异性的结构域。
(4)在生理条件下稳定的Z-DNA可以应用在临床治疗的研究中,例如提高ADAR1编辑酶的靶向性。
原文链接
El-Khoury R, Cabrero C, Movilla S, et al. Formation of left-handed helices by C2'-fluorinated nucleic acids under physiological salt conditions. Nucleic Acids Res. 2024;52(13):7414-7428. doi:10.1093/nar/gkae508