Cell Reports Medicine丨循环微生物 DNA 作为肺癌早期诊断和复发的生物标志物

大家好，今天分享的文献是4月份发表在Cell Reports Medicine上的一篇文章，标题为“Circulating microbiome DNA as biomarkers for early diagnosis and recurrence of lung cancer”。

本文的第一通讯作者是北京大学人民医院胸外科邱满堂副研究员。邱满堂副研究员以第一或通讯作者身份（含共同）在Science Translational Medicine、Science Advances、Cancer Research等杂志发表SCI论文20余篇，H 指数为 24，5 篇为 ESI TOP1%高被引论文，成果被 Science Translational Medicine 杂志官网首页推荐，同时被Nature Reviews Clinical Oncology 撰文评述。研究方向为胸部肿瘤早期检测技术研发、肿瘤微环境中的代谢重编程、基于RNA的创新治疗。

研究背景：

肺癌（LC）是全球第二大常见癌症，也是全球癌症死亡的主要原因。LC的预后与癌症患者的诊断分期显着相关，提高早期检出率是降低LC死亡率的关键。然而，超过80%的LC首诊时处于疾病晚期；目前胸部CT由于假阳性成像结果率高、辐射暴露和成本较高，需要开发新型早期筛查方法。手术是治疗早期LC患者的首选方法，尽管手术治愈了大多数 I–IIIA期LC患者，但其中10%-50%的患者会出现复发，特别是术后3年内复发。因此，开发高准确度的方法来提高LC的早期检测和识别术后复发风险高的患者是至关重要的。

肺的粘膜表面暴露在外部环境中，促进了大量微生物群落的定居。这些微生物群落在肺癌的发展、诊断和预后中发挥着重要作用。随着分子生物学和测序技术的进步，Poore等人发现从外周血中提取的循环微生物组DNA（cmDNA），即非人类的、微生物衍生的DNA，可以区分多种癌症和健康对照（HC），为癌症液体活检开辟了一种新的范式，并表明cmDNA在癌症检测中是一种有价值的工具。然而，cmDNA在LC早期诊断和术后复发中的作用未完全揭示。

整体设计：

图1：本项研究设计

本研究设计如图1所示，共有416名受试者参与了这项研究。对血浆进行5X cfDNA WGS，过滤人源性reads后，使用Kraken2分类、Braken获取cmDNA图谱，从而分析每个受试者的cmDNA特征。

结果：

1. LC与HC的cmDNA图谱

图2：训练队列中所有参与者的cmDNA组成

测序结果表明，HC和LC的人类reads占比分别为98.04%和97.25%，微生物reads占比分别为0.012%和0.009%。接下来，研究者比较了LC和HC的cmDNA多样性和组成。在健康人群中，微生物物种总数显著增加；α多样性分析显示，健康组的Shannon多样性和Simpson多样性均显著高于LC组。在门水平上，变形杆菌、放线杆菌和厚壁菌在两组中的循环微生物群落中占主导地位，其次是拟杆菌和子囊菌（图2A）。

假单胞菌属的相对丰度在LC组显著更高，棒杆菌属的相对丰度在HC组更高（图2B）。研究者对15名cmDNA患者的肺组织进行了肿瘤内微生物组分析，包括肿瘤组织和配对的正常组织，发现假单胞菌序列也在肿瘤组中丰富，尽管没有达到显著性差异。cmDNA前20个富集种主要属于变形杆菌门，其中包括产氮假单胞菌和荧光假单胞菌等在LC组明显增多（图2C）。此外，根据肿瘤大小和肿瘤分期划分的不同LC亚组之间的cmDNA分析显示，cmDNA组成在目水平上保持相对稳定（图2D）。

2. cmDNA panel作为早期肺癌的诊断标志物

图3：差异类群鉴定和肺癌检测模型开发

β多样性显示，LC患者和HC之间cmDNA存在显著差异（图3A）。研究者进行了线性判别分析（LEfSe），以进一步比较cmDNA微生物特征（图3B）。随后，研究者鉴定出46种在LC患者中富集的菌种和130种在HC中富集的菌种，这些菌种可能与肺癌相关（图3C）。研究者进一步选取了119个平均下降精度得分>1的重要特征进行随机森林机器学习模型开发。该模型的受试者工作特征曲线下面积（AUC）为95.6%，灵敏度为81.2%，特异度为90.7%，准确度为86.8%（图3D）。此外，研究者评估了cmDNA panel对于不同肿瘤大小的区分能力：通过五重交叉验证检验各亚组间的区分度，他们发现cmDNA panel对于识别肿瘤较小（<1 cm）和肿瘤较大（>1cm）AUC分别是91.5%和94.0%（图3E）。

研究者分别在两个独立的验证数据集中评估了检测模型的性能。在独立验证I中LC以早期疾病居多（I期，45/48,93.8%），而独立验证II中的LC患者处于晚期（III-IV期，33/33,100.0%）。该模型在外部验证中显示出很高的AUC值，在验证I和验证II中分别为92.1%（95%置信区间[CI]: 86.7%-97.5%）和97.2% （95% CI: 93.7%-100.0%）（图4A）。当合并两个验证队列时，该模型的灵敏度为87.7% （95% CI: 78.0%-93.6%），特异性为79.4% （95% CI: 67.5%-87.9%）， AUC为93.2% （95% CI: 89.2%-97.2%）（图4A和4B）。此外，在两个验证数据集中，LC患者的预测癌症评分明显高于HC患者（图4C）。为了进一步评估该模型的稳健性，在一个独立的小型验证数据集中将WGS测序深度降低到1X后，这些癌症患者的预测癌症评分仍高于截断值（图4D）。

图4：肺癌检测模型的独立验证

3. cmDNA 特征作为肺癌复发的预测标志物

研究者接下来研究了cmDNA微生物特征与临床T1期LC切除患者复发的关系。研究者建立了LC早期复发队列，包括36例术后3年内复发的患者（R组）和65例长期存活3年以上无复发的患者（NR组）。R组和NR组的患者在年龄、性别、吸烟史、肿瘤直径和病理方面匹配。

图5：61例LC患者的R组和NR组差异cmDNA

随后，研究者将复发队列按6：4的比例随机分为训练组和测试组。在训练组中，cmDNA来自61名LC患者（22名R和39名NR）的血浆样本。接下来，研究者研究了cmDNA微生物类群在属和种水平上的变化：在属水平上，不动杆菌属、丛毛单胞菌属和大肠埃希氏菌属等是训练集中最丰富的属（图5A）；在种水平上，研究者确定了R组和NR组之间微生物组成中最丰富的五个物种，即贝雷兹不动杆菌、约翰森不动杆菌、洛菲不动杆菌、睾丸酮丛毛单胞菌和痤疮皮肤杆菌（图5B）。 研究者通过LEfSe分析发现R组富集23个类群，NR组富集39个类群，这些类群可能与术后复发有关（LDA >2, p < 0.05）（图5C）。

图6：术后复发预测模型

随后，研究者探索了利用cmDNA特征来区分R组和NR组患者的可行性。5倍交叉验证的准确率为85.3%，平均AUC值为87.3%。该模型基于cmDNA特征，在训练集中的灵敏度为72.7%，特异性为84.6%，AUC为88.1% （95% CI, 79.7%-96.6%）（图6A）。在测试集中，该模型的灵敏度为71.3%，特异性为84.6%，AUC为80.9%（图6B）。研究者观察到，R组的预测复发评分在训练集和测试集上显著高于NR组（图6C）。Kaplan-Meier生存曲线显示，高危组的无复发生存期（RFS）明显短于低危组 （图6D）。图6E中展示了随机森林分析得出的前20个关键分类群。重要的是，研究者发现嗜甲基菌科与RFS显著相关（图6F）。

总结：

本研究开发了一种基于cmDNA的诊断模型，可以有效地区分早期LC患者和非癌症对照。研究结果还表明，cmDNA作为一种有希望的术后复发生物标志物，可以显著改善患者的预后。

全文链接：

https://www.cell.com/cell-reports-medicine/fulltext/S2666-3791（24）00167-8