Advanced Science丨使用高通量、高灵敏度单核总RNA测序分析泛癌样本

今天分享的文献是2023年11月27日发表在《advance science》上的《Pan-Cancer Single-Nucleus Total RNA Sequencing Using snHH-Seq》。

1.作者介绍

通讯作者郭国骥教授，浙江大学求是特聘教授，博士生导师。现任浙江大学血液学研究所副所长，领导亚太人类细胞图谱计划,主办并主持了2020人类细胞图谱计划亚太会议。团队的科研方向包括干细胞生物学、系统生物学、单细胞分析技术、细胞命运决定、细胞图谱的构建、人工智能等。在国内率先建立了国产化的高通量单细胞分析平台；并成功绘制了全球首张哺乳动物细胞图谱；填补了我国在高通量单细胞测序领域的空白。以通讯作者身份在Nature, Cell, Nature Genetics等著名期刊发表多篇学术论文。

2.背景介绍

单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够在单细胞水平上获取转录组信息，以准确解析肿瘤异质性，但是单细胞测序的技术却并不对所有的样本都适用。临床获取的新鲜肿瘤样本若需要进行scRNA-seq，需要进行快速组织解离，而目前大多数医院的常规病理实验室并不常规进行这种程序，样本库中的冷冻组织等样本也无法进行scRNA-seq。大多数scRNA-seq方法使用oligo-dT引物来捕获和扩增多聚腺苷酸化转录本，而此过程高度依赖于组织样本的质量（降解样本的5’数据会出现缺失）。此外，对许多生物过程很重要的其他没有polyA的RNA样本也无法被oligo-dT 捕获。

3.方法介绍

针对以上问题，研究人员开发了“高通量、高灵敏度单核总RNA测序”（snHH-seq）。该方法在液滴微流控平台中结合了随机引物和pre-index技术。该方法有以下优点：采用单核 RNA-seq测序 (snRNA-seq) 降低了对样品采集和处理的要求；使用随机引物而不是oligo-dT引物进行转录本捕获可以分析部分降解样本，而且可以获得更高的灵敏度（一个转录本有多个捕获位点）和更高的覆盖率（转录本的3'和5’端，同时可以覆盖没有polyA尾的序列。pre-index提供至少一个数量级的通量增益，促进对临床样本的多重分析。

Figure 1 Workflow of the snHH-Seq Platform

 

研究人员先对snHH-seq进行了方法学评估。为评估使用的pre-index和barcode的保真度，使用培养的人类 (293T) 和小鼠 (3T3) 细胞进行了物种混合实验。发现转录后得到的cDNA 的大小为 200–500 bp，无需进行进一步的片段化处理。经过数据处理，研究人员获得了 2290 个细胞核（其中293T细胞细胞核数1122个，中位基因数 4729；3T3细胞细胞核数 1150个，中位基因数 3605），其中细胞双联体不超过 0.8%。同时与基于 Poly(A)进行逆转录的10X Chromium技术不同，snHH-seq 在整个基因坐标中实现了均匀的覆盖。

Figure 2 Validation of the snHH-Seq Platform

 

同时也进行了组织层面的测试，使用含有pre-index和没有的pre-index的 snHH-seq 方法来分析新鲜和冷冻的小鼠大脑。结果显示不同批次的样本在基因分布和细胞聚类方面呈现出较好的重复性，同时冷冻保存的过程及pre-index的过程也并不会显着改变核内基因表达，显示该方法可用于临床样本库中冷冻样本的分析。在小鼠大脑中，snHH-seq分析了10546个细胞并鉴定出19个细胞簇。与10X Chromium进行分析的大脑样本相比，测到了更多不同类型的基因，并包括了lincRNA、snRNA等多种不具有polyA尾的RNA。

Figure 2 Validation of the snHH-Seq Platform（续）

4.应用介绍

在方法学评估后，研究人员进行了应用的探索。接下来，研究人员使用 snHH-seq 分析了冷冻临床肿瘤样本。共计分析了32名肿瘤患者的样本，包括不同的9种肿瘤。将细胞核数据集分为 43 个主要簇，43个细胞簇又可被分为六种主要细胞类型，即上皮细胞、内皮细胞、基质细胞）、免疫细胞、神经元和神经胶质细胞。

Figure 3: identification of Pan-Cancer Malignant Cell Subclusters

为进一步理解肿瘤微环境（TME）异质性，作者对内皮细胞、髓样细胞和基质细胞等细胞类型进行亚群的细分。以肿瘤内皮细胞（TEC）为例，这类细胞可分为15个亚群，其中，尖端肿瘤内皮细胞和细胞周期肿瘤内皮细胞在多种肿瘤类型的样本中均有富集。而毛细血管肿瘤内皮细胞则仅主要存在于癌旁的正常组织中。

目前还没有研究在泛癌水平上通过对恶性细胞进行亚型分析来探求不同癌症类型中的共性。研究人员通过整合来自七种上皮源性癌症的超过300000个恶性细胞来试图解答这个问题。为了消除组织和癌症类型的影响，研究人员从表达矩阵中去除了组织特异性基因，鉴定出具有不同基因表达谱的泛癌恶性细胞的 11 个亚群。研究人员主要着重关注以下两种细胞：C6为肿瘤中常见的一组增殖性恶性细胞，表现出明显的高CNV特征；C10为 高表达纤毛相关基因。由于C10此类型以前从未报道，研究人员对 C10 进行了额外分析。C10亚群细胞高表达一系列运动纤毛相关基因，这一特征与肺部纤毛细胞非常相似，但与正常肺部纤毛细胞之间存在CNV模式差异。这一发现也在人类蛋白图谱数据库（Human Protein Atlas）中也得到验证。

Figure 4.Characteristics of pan-cancer malignant epithelial cell.

 

此外，由于snHH-seq适用随机引物进行逆转录，能实现对转录组各区域（包括内含子区域和非编码区）无偏全长覆盖，因此可以对基因突变进行分析。作者对恶性上皮细胞、非恶性上皮细胞、基质细胞这三种细胞类型中的突变进行分析及比较，发现每种类型都有其特异性突变，每种癌症类型的恶性细胞也具有和癌症类型相关的特异突变。

Figure 5. Mutation and splicing characteristics of malignant epithelial cells.

同时，研究人员还发现一些剪接相关基因的广泛突变，主要关注RNU基因。RNU基因编码小核RNA（snRNA），而snRNA是前mRNA准确剪接的剪接体的必要组成部分。其中RNU1-1、RNU-1-88P、RN6-12P和RN6-30P，在恶性和非恶性上皮细胞中染色体相同位置上发生相同的SNP改变。这些RNU基因突变可能导致细胞中转录和剪接过程变化，以致多个基因出现新剪接位点和剪接模式改变。

Figure 6. Clone analysis of COAD sample.

此外研究人员还探索了与肿瘤转移有关的突变，对一份转移性结肠腺癌样本进行分析。这份样本中恶性细胞可细分为4个不同亚克隆。克隆1为是前体或非恶性细胞，克隆2-4则与原发性肿瘤的发展和进展有关。克隆2为过渡的中间状态，克隆3和4在转移性样本中占比较大，推测在肿瘤转移过程中起到特殊作用。进一步对不同亚克隆突变进行分析后发现克隆3和4中的突变数量较克隆1和2显著增加，表明恶性亚克隆中存在更高的突变负担。同时，在多个亚克隆中还可以观察到经典癌症通路上的突变。

 

5. 总结与讨论

作者开发出一套高通量、高灵敏度的单细胞核全转录组平台。对冷冻保存的泛癌肿瘤样本中73万多个细胞的单细胞核转录组进行分析，构建一个单核转录组数据库，以揭示肿瘤中临床相关细胞类型。同时发现一类新的纤毛相关的恶性细胞。这也是首次在缺乏正常纤毛细胞组织中发现存在类似纤毛的恶性细胞。作者还对突变等生物学事件进行深入分析，这也是该方法相较常规单细胞转录组分析的优势所在。鉴定出一些剪接相关基因的广泛突变与一些与恶性细胞增殖相关的突变特征。