NAT CHEM丨条形码化DNA折纸用于基于DNA的蛋白结合空腔结构的多参数优化和富集
作者：徐锐
本文的通讯作者是来自慕尼黑工业大学的Dr. Simmel教授, 长期从事合成生物学和生物纳米技术的研究，主要研究方向包括了人工分子机器和基于DNA的纳米结构研究，以及人工生物化学电路设计。Dr. Simmel教授于2013年当选为德国工程院院士。
通过多结合位点同时结合一些分子可以极大的降低相应分子复合物的解离常数，从而实现极强的非共价分子间的相互作用。基于这一原则，通几个适配体以极近的距离安装在DNA骨架上，有效地提高了蛋白与DNA纳米结构的结合力。在本文中，作者基于二维DNA折纸构建了纳米空腔，这些纳米空腔可以以设计好的距离和方向安装适配体：例如可控的空间几何排列或者是结合位点的纳米力学特性，进而探索这蛋白与DNA结合的一些设计参数。条形码标记DNA折纸后就可以在相同条件下大规模平行测试这些结合空腔，有利于直接且可靠的量化比较这些空腔与蛋白质的结合效率。文章的作者们根据以上设计方案成功证明了结合物的几何位置和机械特点对于基于折纸的多价结合位点有重要影响，并且通过优化连接链的长度和弹性提高了位点的结合强度。为了更系统地研究和证明配体的空间位置和弹性对于受体结合的影响，DNA折纸空腔内具有多个可以和Aptamer结合的位点。在本文中，已广为人知的凝血酶和链霉亲和素及其适配体为例，通过在空腔中优化上述参数，极大提高了蛋白质与适配体的结合效率。
图1. 正方形DNA折纸结构和组装成的2 X 2阵列的设计。a，DNA结构的分子模型。AFM图给出了折纸结构的细节，为了方便定位，将折纸的四条边分别定义为N , S, E和W。通过进一步的放大图可以看到，折纸内腔有12个对称订书针链可以用来结合适配体，从而控制适配体的方向和位置。b，正方形DNA折纸的2D晶体排列。通过示意图中的链接方式可以得到更大更均一的DNA晶体。U型标记可以用来识别不同的DNA折纸单体。c，通过标记DNA折纸，实现了2 x 2 DNA折纸阵列条形码识别。这样就可以在完全相同的实验条件下比较不同适配体的空间位置对于蛋白质结合效率的影响。
图2. 人凝血酶与折纸上链接长度不同的适配体相结合。a, 不同的构象用于评估适配体HD22 (绿色) 和TBA (橘色) 与折纸连接处的长度及弹性（Spacer）对于凝血酶结合的影响。Spacer有一段刚性的双链茎干和一段灵活的连接链组成（订书针链为黑色，适配体链为红色），茎干的长度从20到30个碱基对不等。茎干和适配体之间通过4个T以单链（A,B,D；橘色圈）或者是与茎干互补的方式插入到茎干中（C,E; 灰色圈）相连接。D和E的构象中在折纸和茎干之间引入了6个未配对碱基，以增加他们的灵活性（黑色圈）。b，根据A和B构象设计的折纸空腔与凝血酶结合的Chimera 模型及AFM 图像。AFM图像和Chimera模型都显示了A构象的适配体需用重新变构才能与凝血酶上的位点结合。
图3. 人凝血酶与不同方向排布的适配体结合。a， 2 x 2阵列中凝血酶与折纸空腔结合的AFM图像。b，11个不同构像的适配体，4个为一组的示意图以及AFM图像。所有适配体都以A类构象结合在折纸上空腔中，在保持HD22位于位置1的情况下，变换TBA1在空腔内的位置。根据AFM的统计学分析表明，两个适配体相对位置成90°（1,4）时与凝血酶的结合效率最高。所有构象的凝血酶结合实验都是在一个反应溶液中进行并且被AFM同时捕获到图像。c，适配体间相对位置为90°（1,4）和180°时与凝血酶结合的产率。直方图展示了适配体在茎干处的灵活性对于凝血酶结合效率的影响。90°构象的结合效率普遍很高。d，2D DNA折纸结构以最佳构象与凝血酶结合形成的晶体阵列（示意图和AFM图像）。灰色方框代表了晶格中的单个DNA折纸。深绿色和浅绿色方框表示晶体中结构的线性排列。
图4. 链霉亲和素与4个相同的适配体在不同构象中的结合。a，链霉亲和素适配体SAA1通过26bp（A）或者20bp（B）的茎干以及4T与订书针链相连接。右图是B类适配体以（1,4,7,10）构象结合链霉亲和素的示意图和AFM图像。b，以2 x 2阵列（条形码3）为例，AFM图像表示不同4个SAA1的在不同空腔中的不同构象。c，4个SAA1的8个用于结合链霉亲和素的构象的示意图和AFM图像。d，与链霉亲和素结合效率最高的构象（2B,3B,5B,6B）的DNA折纸结构晶体的形成。在此种构象中，作者统计到结合效率达到了95%。
图5. 富集与链霉亲和素结合效率较好的适配体构象的纳米结构。a，在2 x 2阵列中，三种适配体排布的示意图。位置1和位置4中SAA1分别位于（1,4,7,10）和（5,6,11,12）。位置2 和位置3分别是SAA2和SAA3以对称的构象排列（1,4,7,10）。AFM图像显示了右边有链霉亲和素和左边没有链霉亲和素的阵列。b，用链霉亲和素修饰的磁珠对高亲和力构象的筛选过程的示意图。将一份109个磁珠与20nM 纳米结构在室温下共孵育30 min，用磁铁分离去除上清液，接下来，用evolution缓冲液清洗磁珠5次（W1-W5），随后用含有不同浓度生物素的洗脱液从低到高依次洗脱（E1-E3, 分别含有0.8, 8, 80 uM生物素）。用SYBR Gold染色的琼脂糖凝胶显示了筛选方法的每一步中DNA结构的含量。（L，ladder；I，起始样品；S，上清液）。d，用E3生物素洗脱液得到的折纸AFM图像。直方图给出了产率。结果表明，2 x 2阵列中位置2和3的构象在该方法中没有被选择。
作者通过一系列的实验证明了基于DNA折纸的方法可以系统性构建多位点结合空腔，以此探索适配体对目标蛋白的结合效率。与之前的工作相比，此方法不仅控制了配体之间的距离，而且还控制了配体之间的相对位置和方向。这些参数对于结合效率都有很大的影响。当然本文中仅仅对2D的结构进行了验证，但是作者认为对于3D的DNA折纸结构同样可以用本方法来进一步探索配体之间的关系对于目标蛋白之间结合效率的影响。
Aghebat Rafat, A., Sagredo, S., Thalhammer, M. et al. Barcoded DNA origami structures for multiplexed optimization and enrichment of DNA-based protein-binding cavities. Nat. Chem. (2020). https://doi.org/10.1038/s41557-020-0504-6
