Sci Adv丨用于CRISPR-Cas9系统可控递送的级联动态组装/解组装DNA纳米框架

大家好，今天分享一篇发表在SCIENCE ADVANCES上的文章，题目为Cascade dynamic assembly/disassembly of DNA nanoframework enabling the controlled delivery of CRISPR-Cas9 system。

本文的通讯作者是天津大学的Dayong Yang教授，课题组以生物大分子DNA为研究主线，聚焦DNA生物功能材料化学组装，探究生命系统运行机制，探索重大疾病的诊断治疗新途径。目前集中进行以下几个方向的研究：

1、核酸化学

2、DNA生物功能材料

3、先进肿瘤诊疗技术

4、合成生物学

背景：

研究表明，CRISPR-Cas9能够显著减少与肿瘤相关的靶基因，从而实现治疗肿瘤的目标。然而，Cas9蛋白具有较大的分子尺寸（约160 kDa），在利用纳米载体进行传递时会遇到空间限制，导致Cas9 ribonucleoprotein (Cas9 RNP)的传递效率较低。另一方面，如何在癌细胞中实现Cas9 RNP的特异性和高效释放一直是一个亟待解决的问题。因此，本研究构建了一种新型级联动态组装/解组装的DNA纳米框架，并将其应用于CRISPR-Cas9系统的可控传递。

文章内容：

如图一所示，作者首先使用N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、BACA和acDNA等单体分子，通过沉淀聚合方法合成了纳米框架（NF）。在这些材料中，acDNA可以在NF内部启动杂交链反应（HCR）。由于HCR产物是长且具有重复片段的双链结构，能够携带更多sgRNA，并扩展NF内部空间，有利于更多Cas9蛋白的负载；NIPAM具有同时亲水的酰胺基和疏水的异丙基，使得在低于临界溶解温度时，NF膨胀并提高Cas9蛋白的负载量；而在高于临界溶解温度时，NF聚集形成尺寸均一的CH-NF。BACA含有二硫键，可响应肿瘤细胞中高表达的GSH，导致CH-NF解组装，暴露内部Cas9蛋白，使Cas9 RNP可控释放，用于基因编辑。

Figure 1. Cascade dynamic assembly/disassembly of NF as a nanocarrier for the controlled delivery of Cas9 RNP

在合成CH-NF后，作者研究了其进入细胞的途径，发现CH-NF主要通过小窝介导的途径进入细胞。如图2所示，CH-NF能在癌细胞（MCF-7细胞）中释放Cas9 RNP，使其进入细胞核。相反，在对照实验中（BEAS-2B细胞）未观察到这种现象，表明CH-NF能够利用高表达的GSH在癌细胞中释放Cas9 RNP。

Figure 2. Cellular uptake and intracellular distribution of CH-NF

随后，如图3所示，作者选择PLK1作为靶基因，并设计了相应的sgRNA，证明CH-NF在细胞和活体层面具有抗肿瘤能力。在细胞层面，CH-NF明显降低肿瘤相关基因的表达，影响基因的转录和翻译，导致相关蛋白表达下降；如图4所示，在活体层面，CH-NF显著抑制肿瘤生长，经CH-NF治疗后的小鼠肿瘤细胞显示异常形态，组织坏死和纤维化。

Figure 3. CH-NF–mediated gene editing in vitro.

Figure 4. CH-NF–mediated therapeutics in vivo.

总结:

本研究采用了级联动态组装/解组装策略，成功合成了能够高效负载Cas9 RNP并实现响应性释放的CH-NF。CH-NF展现出优异的基因编辑效率和显著的体内抗肿瘤效果，同时在正常细胞和主要器官中表现出显著的生物相容性和低副作用，为CH-NF具备进行临床试验的潜力提供了有力支持。通过将DNA与其他分子连接，可能赋予NF更多的动态可调结构和综合功能，例如组织穿透和细胞靶向能力。这种基于DNA的智能纳米系统在精准医学中基因编辑剂的递送领域具有广阔的应用前景。