ANGEW丨一种用于microRNA成像智能脱氧核酸酶可编程催化DNA回路

大家好，本次跟大家分享的文献是2023年武汉大学化学与分子科学学院王富安教授团队发表在Angewandte Chemie上面的A Smart Deoxyribozyme-Programmable Catalytic DNA Circuit for High-Contrast MicroRNA Imaging。该团队首次尝试使用脱氧核酶（DNAzyme）驱动的熵驱动反应（EDR）（下文称为Dz-EDR）在活细胞和体内进行高可靠性、特异性和高效的miRNA成像。这种多重保证的电路提高了传统EDR获取癌细胞中特异性miRNA成像的特异性，有助于构建更复杂的分子电路和网络，以执行生物系统中的各种调节功能。

• 作者介绍：

本篇文章的通讯作者是武汉大学王富安教授，他是武汉大学化学与分子科学学院教授、博士生导师。主要从事生物纳米复合材料与智能医学诊疗等研究，致力于开发肿瘤早期诊疗新方法、核酸信号扩增和多功能核酸纳米药物；在活细胞和活体内高灵敏度成像研究领域积累了丰富的经验，取得了一些进展和系统性、原创成果。截至目前，在相关领域国际权威学术期刊发表论文140余篇。

二、背景：

细胞内分子的灵敏监测在临床诊断和治疗应用中起着至关重要的作用。因此，非常需要开发强大而有效的分子设备来监测活细胞中的生物分子。合成催化DNA电路，如熵驱动反应（EDR），因其简单模块化的优点而引起了关注。但是当前EDR受限于低丰度的目标和拥挤的细胞环境，导致电路灵敏度和选择性不足，开发一种防泄漏且稳定的DNA电路是十分重要的。因此文章报告了首次尝试使用DNAzyme驱动的EDR电路（Dz-EDR），通过DNAzyme模块去解决泄露问题，并将电路用于在活细胞和体内进行高可靠、特异性和高效的microRNA成像。

方案1.常规EDR（A）与通过简单的燃料策略缓解泄漏的EDR系统（B）

对催化EDR电路的深入研究表明，电路之间的串扰（燃料和底物链）会损害其整体传感性能。由于低能量势垒从亚稳态过渡到平衡态，电路元件的动态呼吸和不可避免的缺陷很容易导致不希望的信号泄漏。也就是说在没有分析物的情况下，EDR底物倾向于与完全暴露的燃料链发生非特异性相互作用并释放输出链，从而出现荧光泄露等情况进而损害传感功能的正确执行（方案1A全裸露燃料绞线的常规EDR系统信号泄漏路径示意图）。因此，在保持高信号增益的同时，减少燃料链和底物链之间不需要的杂交对于扩展EDR电路在复杂生物环境中的实际适用性至关重要。为了解决常规EDR电路存在的问题，在本文中，燃料链背景设计在特定的发夹结构中被适度阻断，以屏蔽成核位点并增加成核活化的能量势垒，通过该结构，原则上可以防止在探针输送过程中出现不必要的信号泄漏。通过引入一个智能的现场激活模块，预计笼式燃料链将从感知受阻状态转变为感知就绪状态，以便在内源性信号的先决刺激下激活放大的分析物检测（方案1B通过简单燃料笼策略的泄漏缓解EDR系统的示意图）。

DNAzymes是催化核酸，已被用于构建不同的DNA回路。其中，10-23DNAzyme代表了一种突出的DNA催化剂，已成功用作强大的变构调节元件。内源性刺激的DNA酶可以作为实现EDR成分特异性刺激的理想候选者。作者利用10-23DNAzyme作为燃料发生器，首次尝试了DNA酶驱动的EDR回路。响应Dz-EDR系统由DNA酶介导的燃料转换模块和多功能miRNA感应EDR扩增模块（方案2）组成。

Dz-EDR系统的详细分子反应原理见方案2。催化回路的基本种类是五条DNA链。DNAzyme链（DNA1）和DNAzyme底物（DNA2）构成了燃料转换模块中的参与者，两者都是可编程的发夹结构。miRNA传感模块的EDR底物由三种单链DNA组成：报告链（DNA3）、辅助链（DNA4）和淬灭基团链（DNA5）。DNA3在其3'端用羧基荧光素（FAM）荧光团标记以输出信号，而DNA5在其5'端用淬灭剂（BHQ-1）单元标记，从而有效淬灭FAM荧光团。

在DNAzyme介导的燃料转换模块中，反应物发夹DNA1由mRNA互补序列（紫色）和10-23DNA酶结构域（灰色）组成。没有激活剂TK1mRNA，DNA酶部分被限制在发夹的茎区域，没有催化活性。在TK1mRNA存在的情况下，DNA1可以通过链置换反应被mRNA特异性激活，导致mRNA-DNA1杂交体的形成以及并且暴露辅因子Mg2+。Mg2+将DNA酶活化后可以与DNA2的环结构域杂交，以催化rAU位点底物的持续切割。结果，热力学不稳定的裂解产物自发解离成片段1和片段2，其中片段2（橄榄绿）作为燃料，为随后的miRNA感应EDR模块中的熵驱动的链位移反应提供动力。

方案2.（A)DNAzyme介导的燃料转换模块（B)多功能miRNAEDR放大模块

在miRNA传感模块中，靶microRNA-21（miR-21）的序列m-a与DNA5的结构域m*-a*互补，因此靶标可以通过分支迁移反应（分支迁移：DNA双链体中部分配对的DNA链，通过顶替它的同源链而扩展其配对的过程。）与DNA5杂交形成中间杂交。随后，新暴露的DNA5的b*与片段2的结构域b结合形成亚稳结构，可以快速重排以释放miR-21用于回收靶标，并分解DNA3以产生荧光输出信号。在整个过程中，miR-21作为催化剂，通过一系列分支迁移和熵驱动的反应过程触发EDR系统。一旦Dz-EDR系统的传感功能被TK1mRNA激活，通过mRNA活化的DNAzyme进行的连续切割反应就会产生大量的片段2，用于通过产生显着放大的读出信号来持续激励miR-21触发的EDR模块。考虑到DNAzyme扩增燃料生产的先决条件作用，他们所设计的Dz-EDR系统编码的细胞特异性显着提高，因为其miRNA传感功能只能由癌细胞的内源性胸苷激酶1（TK1）mRNA激活。相反，由于正常细胞中缺乏TK1mRNA，因此无法产生燃料链，从而无法实现正常细胞的细胞内成像。通过将多重刺激响应性集成到EDR系统中，DNAzyme驱动的EDR可以减轻传统EDR原理的信号泄漏。作为一个多功能且功能强大的工具箱，这种顺序和倍增保证电路还可以提高传统EDR在癌细胞中获取特定miRNA成像的特异性。

三、研究结果：

接下来是作者进行的这个系统的可行性验证。DNAzyme驱动的EDR电路的成功运行取决于DNAzyme生物催化的有效激活（图1A）和EDR电路的催化熵驱动的链置换（图1B）。因此，作者团队通过（非变性PAGE）分别探索了这两种构成系统的可行性，以确保他们所集成的Dz-EDR系统的正确执行（图1C和1D）。首先，是图1c所示燃料转换模块的性能确认。这里涉及三条DNA链，包括TK1mRNA（泳道1）、DNA酶笼DNA1（泳道2）和相应的底物编码DNA2（泳道3）。TK1mRNA与DNA1杂交形成mRNA-DNA1双链体（泳道4）。在没有激活剂TK1mRNA（泳道5）的情况下，没有出现新的条带，表明发夹混合物（DNA1和DNA2）稳定共存。在发夹混合物中加入TK1mRNA后，观察到mRNA-DNA1双链体的分子量条带较高，TK1mRNA和DNA1的条带同时减弱。由此产生的mRNA-DNA1双链体导致DNAzyme链完全暴露，以激活DNA2的催化切割，从而产生片段1和片段2的两个新产物条带，以及消失的DNA2条带（泳道6）。这些结果表明，只有在TK1mRNA存在的情况下，DNA1才能被打开，以激发DNAzyme介导的DNAzyme底物的连续切割，并最终产生用于后续EDR回路的燃料链。

图1.分模块原理示意图以及各自凝胶电泳图

然后他们验证了EDR模块的熵驱动链置换反应（图1D）。这里涉及三个组分，包括miR-21（泳道1）、片段2（泳道5）和EDR底物（泳道6）。链DNA3*（泳道2,10碱基延伸率，用于鉴别）、DNA4和DNA5（分别为泳道3和4）退火以形成EDR底物（泳道6）。片段2和DNA5退火，形成废双链体，作为参考条带（泳道7）。可以看到，在没有片段2的情况下，将miR-21添加到EDR底物中会产生中间双链体（泳道8），在片段2（泳道10）的帮助下，可以有效地转化为废物片段以再生miR-21。相反，在没有miR-21分析物的情况下，将片段2添加到EDR底物会导致信号泄漏，如生成的少量催化产物所示（泳道9）。

可行性验证之后作者又对集成Dz-EDR电路的传感性能进行了验证。为了获得令人满意的催化DNA回路传感性能，通过信背景比和信号放大比评估反应物浓度、周围温度和反应缓冲液。在50nMDNA1、100nMDNA2和200nMEDR底物下实现了最佳传感性能。

图2.验证Dz-EDR电路的激活模块性能

如图2A所示，在存在TK1mRNA的情况下，燃料转换模块成功实现，为目标miR-21触发的EDR电路供电，以产生放大的荧光读出信号。在没有激活剂mRNA的情况下，燃料链被限制在发夹结构中，即使在靶标miR-21存在的情况下，也能有效阻断EDR系统（图2B）。此外，他们还进行了实时荧光实验，以监测集成的Dz-EDR系统。如图2C所示，曲线a：DNA1+DNA2+EDR底物的Dz-EDR混合物没有明显的荧光变化，表明燃料阻断系统的信号泄漏较低。曲线d：同时添加激活剂mRNA和靶miR-21，观察到荧光强度明显增加，并在3小时后达到平台值。同时，曲线b：仅TK1mRNA或曲线c：miR-21触发的荧光强度略有增加，并且该荧光变化明显低于完整的Dz-EDR系统。轻微的荧光变化归因于这些组分之间的非特异性相互作用。

上诉结果表明，目前的Dz-EDR电路可用于靶miRNA的扩增检测。图2D为根据推导的校准曲线，计算出miR-21的检测限为3pM。同时，随着miR-21浓度的增加，无TK1mRNA参与的失活Dz-EDR的荧光信号几乎保持不变，表明mRNA激活的DNAzyme放大器是整个系统的组成部分。显然，TK1mRNA激活的Dz-EDR系统在miR-21检测方面表现出显着改善的传感性能。

图3.Dz-EDR电路的细胞内成像能力的可行性演示

接着他们将Dz-EDR电路进行细胞内成像能力的可行性论证。如图3A所示，用缺陷的DNA1*和DNA2*替代正确DNA以及含miR-21抑制剂的电路，递送进miR-21高表达细胞进行胞内成像，仅有正确且完整Dz-EDR电路有明显荧光信号。

他们首先选择MCF-7细胞（miR-21高表达）作为模型系统，通过流式细胞术分析探索优化的孵育时间。荧光在3h后达到平台期，因此被选为后续细胞内生物传感研究的最佳孵育时间。此外，采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）通过引入用缺陷的DNA1*和DNA2*替代正确DNA以及含miR-21抑制剂(抗miR-21寡核苷酸（AMO，一种用于下调细胞内miR-21的高效miR-21抑制剂），来探索Dz-EDR系统的细胞内传感可行性和能力。递送进miR-21高表达细胞进行胞内成像，仅有正确且完整Dz-EDR电路有明显荧光信号。在与有缺陷的Dz-EDR（a）或无效的Dz-EDR（b）一起孵育的MCF-7细胞中观察到明显较低的荧光信号，表明Dz-EDR系统的功能完整性对于监测活细胞中miR-21的表达至关重要。同时，在具有完整Dz-EDR的活MCF-7细胞中观察到增强的荧光读数（c），而在用AMO抑制剂（d）预处理的Dz-EDR孵育的MCF-7细胞中观察到微弱的荧光信号，表明放大的荧光信号确实是从靶标miR-21产生的，并且该系统也具有高特异性编码。这些结果证实了强大的DNAzyme驱动的EDR电路可以可靠地用于miRNA分析物的细胞内成像。

图4.Dz-EDR电路的刺激响应性的验证

接下来为了证明Dz-EDR系统的特异性反应他们首先将TK1mRNA反义寡核苷酸（ASO，作为抑制剂）转染到MCF-7细胞中，使内源性TK1mRNA沉默3小时，然后将这些细胞与Dz-EDR系统再孵育3小时（如a所示）b所示为只在完整的Dz-EDR进行孵育（图4A）。图B是用不同方式的Dz-EDR系统处理这些不同的细胞后，通过共聚焦在细胞中获取荧光读出信号。结果表明，与完整的Dz-EDR处理的MCF-7细胞相比，TK1mRNA下调的MCF-7细胞的细胞内荧光信号显着降低，并且该结果与流式细胞术分析的结果一致。这些实验表明，集成的Dz-EDR系统只能在TK1mRNA激活的帮助下感知靶miR-21，这与试管中的体外演示一致。因此，只有在存在内源性TK1mRNA刺激的情况下，才能激活DNA酶以产生大量燃料链，从而通过熵驱动的EDR系统促进扩增的miR-21检测。

图5.Dz-EDR电路对不同细胞的区分

mRNA和miRNA的同时变异表达使我们的集成Dz-EDR系统能够通过选择性地识别不同类型的细胞。为了研究Dz-EDR系统区分不同细胞类型的能力，他们选择了癌细胞MCF-7和HeLa作为miR-21和激活子TK1mRNA高表达的阳性细胞系，以及正常细胞MCF-10A作为miR-21和TK1mRNA低表达的阴性对照。正如在共聚焦图像中所示（图5），在37°C孵育3小时后，与Dz-EDR一起处理的这些不同细胞中检测到不同的荧光强度。在MCF-7细胞中产生了更强的信号，其次是HeLa细胞。然而，在MCF-10A细胞中几乎没有检测到荧光信号。这些结果表明，Dz-EDR系统可以根据细胞对多种内源生物分子（特异mRNA和miRNA）的表达差异来区分肿瘤细胞和正常细胞，为细胞鉴别提供了更可靠的基础。

图6.不同电路在肿瘤小鼠体内成像及荧光信号统计

在这些体外特异性mRNA驱动的miR-21感应性能的鼓舞下，接下来他们在肿瘤模型中进一步研究了Dz-EDR系统的体内成像能力。通过尾静脉将这些不同的探针递送至荷瘤裸鼠体内（图6A），并用于进一步探索Dz-EDR系统的体内传感和成像能力。如图6B所示，Dz-EDR处理的完整小鼠（样品a）的肿瘤部位显示出明显增强的荧光信号。请注意，在非肿瘤区域观察到轻微的脱靶效应，这可能归因于核酸酶介导的探针在复杂生理环境中不可避免的降解。同时，对于传统的EDR处理的小鼠（样品b），在非靶位点出现强烈的背景荧光，这是由于EDR电路的组合探针降解和场外激活。虽然在Dz-EDR处理的小鼠中获得了高对比度成像结果，但受益于EDR燃料链的位点特异性激活。这可有效降低场外信号泄漏，实现对目标miR-21的现场成像。此外，12h后，对这些不同处理小鼠的荧光强度进行定量分析显示，Dz-EDR组（样品a）比传统EDR（样品b）、缺陷Dz-EDR（DNA1*取代的Dz-EDR，样品c）、无效的Dz-EDR（DNA2*取代的Dz-EDR，样品d）和抗TK1mRNA预处理的Dz-EDR（样品e）高1.49倍、2.43倍、2.58倍和2.18倍，分别（图6C）。上述结果证实了所提出的Dz-EDR可以应用于生命系统中的位点特异性miRNA成像。

总的来说在这篇文章中作者开发的Dz-EDR系统的燃料链被封锁为发夹结构，以整合mRNA介导的脱氧核酶激活过程，在保持高信号增益的同时减少了燃料链与底物之间的交叉杂交，减少了泄露。由于miRNA传感功能只能被癌细胞的内源性TK1mRNA激活，Dz-EDR系统具有显著提高的细胞特异性，在体内实现了可靠、高特异性和高效的miRNA成像。3该工作可能有助于构建更复杂的分子电路和网络，以在生物系统中执行各种调节功能。