Developmental Cell丨RanGAP1 的缺失导致染色体不稳定和骨肉瘤的快速发生

大家好，今天分享的文献来自南方医科大学基础医学院白晓春、邹志鹏研究团队，题为 Loss of RanGAP1 drives chromosome instability and rapid tumorigenesis of osteosarcoma 于2023年2月在Developmental Cell上发表。

研究背景

染色体不稳定（chromosome instability, CIN）是由细胞分裂后期染色体持续分离错误引起，它会导致异倍体形成，促进肿瘤发生。染色体碎裂是CIN的一个极端现象，涉及局部区域内密集的碎裂和重排，然而引起染色体碎裂导致肿瘤快速发生的机制尚不清楚。

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）因频繁产生异倍体，有异常高的染色体重排率，所以OS成为研究CIN与肿瘤发生关联的绝佳模型。而在临床上OS是青少年和儿童中最常见的恶性肿瘤，具有高度侵袭性和早期转移性，但其发病机制尚不明确，同时也缺乏有效的治疗手段。

本文工作

RanGAP1缺失是骨肉瘤的普遍现象

CIN、非整倍性和肿瘤发生是某些肿瘤类型中SAC基因异常的结果。为确定CIN驱动OS的潜在基因，作者在数据库中检索了OS的mRNA数据集，查找纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint ，SAC）高度保守的核心成分BUB1-3, MAD1-3L1和Mps1, 39-41等基因的变化。与对照相比，OS中的RanGAP1 mRNA显著减少(图1A)。在OS细胞系中进一步证实RanGAP1蛋白减少 (图1B)。免疫组织化学(IHC)染色显示与对照样品相比，在两种OS组织阵列110个OS样品中，RanGAP1蛋白普遍减少(图1C)。人类儿童OS样本的western blotting(图1D)和一个包含原发性和复发性样本的队列的IHC中RanGAP1蛋白减少 (图1E)。OS样品中成骨标志物Osx和Ocn表达增加(图1F)， Ki67和增殖细胞核抗原表达增加(图1G)，表明RanGAP1缺失的OS样品既具有高增殖性又具有成骨性。综上所示，RanGAP1缺失可能是OS发生的常见因素。

Figure 1. RanGAP1 loss is a universal event in OS.

RanGAP1缺失驱动自发性骨肉瘤，重现了人类儿童骨肉瘤的发病年龄和骨骼部位

为进一步了解RanGAP1与骨肉瘤发生的因果关系，作者建立了RanGAP1^OP KO（RanGAP1fl/fl；sp7-Cre）小鼠模型（补充数据），该模型中RanGAP1在骨祖细胞中被特异敲除。RanGAP1^OP KO小鼠在多个部位出现肿瘤生长 (图2A)，与儿童骨肉瘤的发病位点极其相似。HE染色显示肿瘤向髓腔的浸润(图2B)。随年龄增长大多数小鼠在20±5天内死亡 (图2C和2D)。影像学显示骨结构紊乱 (图2E)。2周龄小鼠股骨和胫骨的HE染色显示成骨OS的渐进性组织病理学特征（图2F）。RanGAP1^OP KO小鼠的肿瘤病变表现出成骨性OS的特征碱性磷酸酶(ALP)染色增强(图2G)、Ki67和PCNA免疫染色均显示增殖率增加(图2H)。综上所示RanGAP1敲除导致高度增殖和成骨性骨肉瘤的形成。

Figure 2. RanGAP1 loss drives spontaneous OS, recapitulating the onset age and skeletal sites of human pediatric OS.

RanGAP1缺失驱动染色体裂解和非整倍体激活致瘤途径，同时逃避监测

RanGAP1缺失后的原代骨肉瘤细胞表现出高水平的非整倍性(图3A和3B)。光谱核型(SKY)示一些肿瘤细胞接近四倍体，这是人类高级别OS的特征(图3C)。在RanGAP1缺失的OS细胞中，滞后染色体和染色体桥的百分比远高于对照细胞(图3D)。RanGAP1缺失的OS细胞中DNA损伤(g-H2AX阳性)的微核发生率高(图3E)。对RanGAP1^OP KO小鼠的OS组织进行全基因组测序分析及相关实验验证，发现RanGAP1缺失导致chr1q染色体碎裂(图3F)，p53降解（图3H），Mdm2和Mdm4的蛋白表达增强，但Mdm2 mRNA未上调(图3I)。肿瘤抑制因子Rb1 表达减少(图3j，K)，PI3K-Akt通路激活(图3G)，加速骨肉瘤发展。

Figure 3. RanGAP1 loss drives chromothripsis and aneuploidy to activate tumorigenic pathways while evading surveillance.

RanGAP1缺失足以驱动体外CIN、非整倍体和恶性转化

为进一步确定RanGAP1缺失是否足以在体外驱动恶性转化，用腺病毒编码的Cre感染RanGAP1fl/fl小鼠的胚胎成纤维细胞(mef)，在体外沉默RanGAP1 (图4A)。染色体G带证实了严重的非整倍体和高比例的复杂核型 (图4B)。RanGAP1缺失的mef提示异常有丝分裂，滞后染色体,后期桥及微核 (图4C,D,E)，这些都容易发生CIN和非整倍体形成。活细胞成像示RanGAP1缺失MEF示染色体桥(图4F)和滞后染色体。RanGAP1缺失的mef表现出明显延长的后期和末期(图4G)。RanGAP1缺失的mef在早期传代时显示出细胞死亡增加，这可能反映了由非整倍体引起的有丝分裂灾难的迹象。而活下来的mef在传代后期表现出明显增强的增殖, 集落形成, 迁移(图4H,I ,J)，表明一种永生化机制得以在灾难中存活下来。将转化的RanGAP1缺失mef(而不是对照mef)皮下移植到裸鼠体内，导致肿瘤生长(图4K)。为模拟体外急性诱导CIN和非整倍体的过程，在初级颅骨骨祖细胞中沉默RanGAP1 (图4L)证实该系统的效率。与mef类似，这些RanGAP1缺失的骨祖细胞也表现出异常的有丝分裂结构 (图4M,4N)。综上在OS中靶向RanGAP1可预防CIN、非整倍体和恶性转化。

       Figure 4. RanGAP1 loss is sufficient to drive CIN, aneuploidy, and malignant transformation in vitro

RanGAP1通过将PP1募集到动粒以抵消KNL1磷酸化来防止SAC过度激活

为确定RanGAP1在染色单体分离中的靶点，对MC3T3-E1骨祖细胞中的RanGAP1相互作用蛋白进行蛋白质组学。RanGAP1与PP1-g的相互作用得到进一步证实(图5A)。GST-pull down示RanGAP1与PP1-g直接结合(图5B)。接下来研究RanGAP1是否需要PP1-g与着丝点结合并抵消KNL1磷酸化。RanGAP1缺失不影响PP1-g的表达(图5C)，但阻断PP1-g向着丝点的定位(图5D)。因此RanGAP1缺失的细胞表现出明显增加的KNL1磷酸化，特别是当有丝分裂被nocodazole (NOC)阻断时(图5E和5F)。转基因小鼠组织样品示KNL1磷酸化水平持续升高(图5G)。相反RanGAP1过表达降低了PP1-g缺失增强的KNL1磷酸化(图5H)。人OS样本中RanGAP1表达也与KNL1磷酸化呈负相关(图5I)。RanGAP1缺失OS细胞示前期MAD2向着丝点的募集显著增加，可通过同时使用BAY1217389(一种选择性Mps1抑制剂)进行逆转(图5J)。在缺乏内源性RanGAP1的细胞中，GAP活性(R91A)或ran结合能力(S358A)受损的RanGAP1突变体逆转了KNL1的磷酸化，野生型RanGAP1也是如此(图5K)。综上示RanGAP1通过将PP1-g招募到着丝点上来限制KNL1的磷酸化。与对照OS细胞相比，RanGAP1缺失的OS细胞的后期和末期明显延迟，这与染色体桥和滞后染色体有关，活细胞成像示(图5L和5M)。有丝分裂延迟表明SAC过度激活。

Figure 5. RanGAP1 prevents SAC overactivation by counteracting KNL1 phosphorylation

RanGAP1在有丝分裂中阻止cdh1介导的Top2a降解，以保护染色单体分离

对对照组和RanGAP1^OP KO小鼠OS组织进行蛋白质组学分析。结果提示OS细胞中染色单体分离所必需的TOP2A显著下调(图6A)。RanGAP1^OP KO肿瘤和各种RanGAP1缺失细胞中TOP2A缺失(图6B)。TOP2A下调与人类OS样本中RanGAP1减少有关（图6C）。而RanGAP1缺失在mRNA水平上不影响TOP2A的表达(图6D)。RanGAP1过表达延迟了TOP2A对蛋白合成抑制的反应(图6E)，表明RanGAP1稳定了TOP2A而不是促进其蛋白合成。RanGAP1缺失的MC3T3-E1细胞示明显增强的TOP2A泛素化(图6F)。综上示RanGAP1缺失后TOP2A下调是由泛素蛋白酶体介导的降解调节的。Co-IP显示MC3T3-E1细胞中，RanGAP1与TOP2A能够相互作用(图6G)。GST pull down进一步证实两者相互作用 (图6H)。据报道TOP2A泛素化并以APC/ ccdh1依赖的方式降解。因此假设RanGAP1可能具有抑制TOP2A降解的功能。为支持这一观点，发现RanGAP1和TOP2A都与Cdh1结合(图6I)，并且RanGAP1的缺失增强了Cdh1与TOP2A的结合(图6J)。相反将RanGAP1加入到含有体外翻译的Cdh1和GST-TOP2A的结合反应中，会削弱它们之间的结合(图6K)。这些表明RanGAP1阻止Cdh1与TOP2A结合。最后无论是在RanGAP1缺失的细胞中同时沉默Cdh1(图6L)，还是在Cdh1过表达的细胞中共表达异源RanGAP1(图6M)，都能显著挽救TOP2A的降解。RanGAP1在TOP2A稳定中的作用在很大程度上与Ran GTPase无关，因为在内源性RanGAP1缺失的细胞中，具有GAP活性受损(R91A)或Ran结合能力受损(S358A)的RanGAP1突变体与野生型RanGAP1一样，挽救了TOP2A的降解(图6N)。综上示RanGAP1限制了Cdh1进入TOP2A并阻止其蛋白酶体降解。

Figure 6. RanGAP1 prevents CDH1-mediated Top2a degradation in mitosis to safeguard chromatid decatenation

联合抑制SAC活性和TOP2A降解可减少RanGAP1缺失小鼠和患者来源的肿瘤异种移植物的肿瘤生长

研究者在RanGAP1缺失的小鼠中，通过使用药物联合抑制SAC活性和TOP2A降解，可以减少小鼠异种来源肿瘤移植物中的快速生长。这有望为骨肉瘤的治疗带来新的突破口。

Figure 7. Combined inhibition of SAC activity and TOP2A degradation reduced tumor outgrowth in RanGAP1-depleted mice and patient-derived tumor xenografts