Developmental Cell 丨 SFPQ凝聚物封存Smad4阻断TGF-β的肿瘤抑制信号传导
大家好，今天给大家分享的文献是发表于 Developmental Cell上题为《Smad4 sequestered in SFPQ condensates prevent TGF-β tumor-suppressive signaling》的文章。
作者介绍
本文通讯作者是来自浙江大学生命科学研究院的冯新华教授和肖睦副教授，主要研究方向为癌症的发生和转移以及干细胞与发育。
研究背景：
转化生长因子（TGF-β）是调控细胞稳态的多功能细胞因子，参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程。激活的TGF-β受体磷酸化Smad2和Smad3蛋白，从而与Smad4形成异源复合物，调节细胞周期相关基因的表达。TGF-β信号通路的失调与癌症密切相关：在癌症早期，TGF-β通过抑制细胞周期和促进细胞凋亡，表现出抑制作用；而在晚期增加肿瘤的侵袭和转移。TGF-β生长抑制功能的丧失是癌症的标志，然而其机制尚未完全明确。
富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪切因子（SFPQ）是DBHS家族的一员，在RNA剪接和DNA修复中起重要作用，与NONO、PSPC1、NEAT1共同形成核内paraspeckles。
结果：
- SFPQ减弱了TGF-β介导的基因表达和生长抑制响应
为了探究哪些RNA结合蛋白（RBP）在TGF-β信号传导中发挥功能，作者使用Smad-binding element（SBE）-luciferase的方法在HaCaT、MCF-10A和Huh1三种细胞系中对RRM家族的RBP进行无偏功能筛选，发现SFPQ得分最高（图1A）。使用RNA-seq对敲低（KD）SFPQ的HCC细胞进行分析，对照HLE细胞中有310个基因响应了TGF-β介导的差异化表达，而在SFPQ KD HLE细胞中增加到936个（图1B）。此外，TGF-β介导了对照组细胞中大多数基因的下调，而SPFQ KD增加了细胞对于TGF-β的敏感性，表明SFPQ参与调节TGF-β信号通路（图1C）。随后，作者构建了敲除（KO）SFPQ的HLE细胞，发现SFPQ KO显著影响了TGF-β信号通路下游基因的表达（SERPINE1、CDKN2B、MYC）（图1 D-G）。作者还研究了SFPQ过表达/KO HLE细胞对于TGF-β调节的DNA合成和G1期停滞的影响，SFPQ KO显著增强了TGF-β介导的生长抑制反应，而过表达体系削弱了相关响应（图1H, I）。
图1 SFPQ削弱TGF-β介导的转录和生长抑制响应
- TGF-β诱发SFPQ和Smad的相互作用
为了了解SFPQ抑制TGF-β信号传导的机制，作者结合质谱和免疫共沉淀（IP）发现SFPQ与Smad4有相互作用，并且受到TGF-β的调节（图2A）。邻近连接技术（PLA）也证实了二者于TGF-β作用下在细胞核内形成内源性复合物（图2B）。此外，重组SFPQ也能与GST-Smad4有直接相互作用（图2C）。因SFPQ由1个PrLD、2个RRM、1个NOPS和1个CC结构域组成（图2D），作者研究了多个突变体，意外发现N端前27个氨基酸与Smad4有相互作用，并将该结构域定义为Smad-binding domain（SBD）。对于Smad4而言，MH2是负责与SFPQ相互作用的结构域（图2D-F）
图2 SFPQ与Smad4结合并抑制了Smad复合物的形成
- SFPQ阻碍了Smad复合物的形成
作者发现SFPQ不影响Smad2和Smad3的磷酸化以及Smad蛋白的亚细胞定位。然而，在SFPQ过表达的Hep3B和HLE细胞中，TGF-β介导形成的Smad复合物严重减少，但不影响Smad2和Smad3之间的相互作用；一旦将SFPQ KD或KO则增强了TGF-β的作用（图2G），ΔSBD突变体也能获得类似的结果(图2H)。说明SFPQ结合Smad4，阻碍Smad复合物的形成。
- SFPQ通过PrLD形成凝聚物
因SFPQ含有PrLD（图3A），所以作者探索了它形成凝聚物的能力，使用免疫荧光染色（IF）揭示SFPQ能在多种HCC细胞中形成4-10个直径为30-100 mm的点状凝聚物（图3B-C）。为了让SFPQ凝聚物可视化，作者在其C端knock in了mEGFP，且不影响SFPQ的行为，而1,6-HD可以很好地溶解SFPQ凝聚物（图3D）；使用光漂白荧光恢复实验（FRAP）对凝聚物的迁移率进行测定，其荧光恢复率在2min能超过60%，表明凝聚物是高度动态的，稀释相的凝聚发生在分钟尺度上（图3E）。作者使用了重组SFPQ-mEGFP在体外研究相分离现象，随着时间的推移，SFPQ能形成1-2 μm的液滴（图3G, H），FRAP后能在4min内恢复（图3I, J），并且在1,6-HD处理后消失但不受RNA影响，说明SFPQ发生相分离是独立于RNA的（图3 K）。
为了确定SFPQ发生LLPS的驱动因素，作者做了各结构域的突变体，除了删去PrLD其余结构域的突变并不影响它LLPS的能力，且将PrLD中所有Pro突变为A（88PA）也能使SFPQ无法形成液滴，支持了重复的Pro有助于大分子之间的疏水相互作用的论点（图3L）。
图3 SFPQ经过相分离形成生物凝聚物
- SFPQ募集Smad4到自身凝聚物中
作者发现重组Smad4和Smad3能在拥挤环境中形成纤维状聚集体（图4A），且SFPQ和Smad4在生理浓度下可形成了异形球状液滴，由Smad4包裹SFPQ（图4B）。Hep3B细胞经TGF-β处理后，Smad4从质转移至核，并且SFPQ由均质转变为含Smad4的凝聚物，且随着时间推移变得更大更明显（图4C）。
图4 SFPQ通过PrLD-介导的相分离隔绝Smad4
- SFPQ相分离引发Smad复合物解离
在coIP实验中，HLE细胞经TGF-β处理后明显提高了SFPQ-Smad4的复合物水平，而Smad复合物水平降低（图4D），为了验证这一结果，作者辅以体外竞争实验，发现随着孵育时间的增加，SFPQ降低了预先形成的Smad3-4复合物的水平，而失去LLPS能力和结合Smad4的SFPQ突变体无法解离Smad3-4复合物（图4E）。在细胞中也观察到类似的结果，SFPQ过表达显著减少了Smad3-4复合物的形成，ΔSBD＆88PA的SFPQ完全失去了抑制Smad复合物形成的能力（图4F）。且仅含有SBD和PrLD的mini-SFPQ就足以从Smad3-4复合物中隔离Smad4（图4G）。用hnRNPA1的PrLD替换SFPQ原本相同的结构域（SFPQA1）也可发生相分离并且封存Smad4，而突变体（SFPQA1MT）不行。这些结果表明只有SFPQ同时具备SBE和LLPS的能力才能抑制Smad复合物的形成（图4G）。
- SFPQ抑制TGF-β信号通路依赖于自身结合Smad4和相分离的能力
作者检测了各种SFPQ突变体对于TGF-β通路下游基因表达水平及其抗增殖能力（PCNA表达水平和EdU染色）的影响。与图1结果一致，SFPQ显著降低了相关基因的表达，还阻止了SERPINE1启动子募集Smad4，而ΔSBD的抑制能力丧失（图5A-C）。Smad4结合和LLPS能力缺陷的SFPQ未能阻断SBE-luc反应（图5D），还破坏了其抑制TGF-β介导的抗增殖能力（图5E-G）。表明SBD和PrLD对于SFPQ抑制TGF-β信号通路至关重要。
图5 SFPQ抑制TGF-β信号通路依赖于自身结合Smad4和相分离的能力
- SFPQ相分离促进细胞增殖和肿瘤发生
作者在肝内植入模型中，将SFPQ过表达的Huh7-luc细胞注射至小鼠肝脏内，检测到多个肿瘤结节和强烈的生物发光信号，而SFPQ-KO没有观察到宏观肿瘤（图6A, B）。此外，使用了尾静脉注射法构建肝细胞癌小鼠模型探索SFPQ对于MYC驱动肿瘤生长的作用，SFPQ、MYC共表达小鼠相比于对照组出现了更大、更多的肿瘤（图6C-E）。并且SPFQA1小鼠也出现相同现象，但相应LLPS缺陷型没有观察到肿瘤结节（图6F, G）。表明SFPQ的相分离能力加速HCC细胞形成。
- SFPQ上调与HCC患者低生存率有关
鉴于在小鼠模型中观察到SFPQ利于肿瘤发生，作者使用IHC发现肝脏肿瘤中SFPQ上调（图6H）。通过分析The Cancer Genome Atlas（TGCA）和独立的HCC数据集，与邻近非癌性肝组织相比，HCC中SFPQ蛋白水平更高、mRNA水平上升（图6I, J）。Kaplan-Meier生存分析显示，SFPQ高表达的HCC患者总生存期明显低于低表达患者。表明SFPQ在HCC中高表达与HCC患者的生存率相关。
图6 SFPQ相分离有利于HCC肿瘤发生
讨论：
本篇文献报道SFPQ LLPS将Smad4从Smad复合体中分离出来，从而抑制TGF-β活性，这有助于理解相分离的调控作用。在本研究中确定了SFPQ不需要其RNA结合活性来阻断TGF-β信号传导。相反，SFPQ的LLPS是HCC细胞摆脱TGF-β介导的生长抑制所必需的。尽管LLPS的失调与年龄相关的神经变性有关，但其在肿瘤发生中的活性尚未得到很好的表征。本研究结果为理解生物分子凝聚物如何促进信号失调引起的疾病提供了见解。针对SFPQ凝聚物潜在治疗方法的发展有助于改善HCC患者的预后和治疗。
