NAT MATER丨树突状细胞的代谢标记和靶向调控
作者：李好问
非天然的糖代谢通过化学标签成为细胞膜标记的强大工具，并用于靶向兴趣分子的释放和传递。这项技术已经用于癌症的靶向化疗、光热治疗及光声治疗。研究人员努力将这种方法扩展到癌症免疫研究领域。树突状细胞（DCs）作为适应性免疫反应的介质，是强大的抗原提呈细胞，是癌症免疫治疗中的重要靶点。DCs在骨髓中产生，迁移至淋巴和周围组织，在病原体和肿瘤抗原的作用下成熟。常规的DCs追踪方法是荧光或放射性标记，但是由于缺乏原位的明确标记难以进行后续的靶向追踪，更加无法靶向调控。至此，是否可以将非天然的糖化学标签方法用于DCs细胞的标记追踪，并且通过化学方法进行靶向调控呢？
近日，哈佛大学David J. Mooney院士课题组在国际学术期刊《自然-材料》（Nature Materials.）上发表研究论文《Metabolic labeling and targeted modulation of dendritic cells》，报道了基于非天然糖化学标签对树突状细胞进行代谢标记及靶向调控用于肿瘤免疫。
研究人员证明DCs可以在体内和体外通过化学标记的方法用于长时间追踪和靶向调控。采用叠氮标记的非天然糖可以标记细胞膜表面的糖蛋白，利用一种可注射的海藻酸凝胶释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），将DCs聚集在接种位点，并且控制叠氮糖分子的释放。除了标签追踪DCs外，叠氮基团通过高效的点击化学反应靶向携带二苯并环辛炔（DBCO）基团的肿瘤抗原、免疫佐剂、细胞因子及其他免疫调节因子，实现免疫调控。采用该策略可以容易地产生肿瘤免疫反应，并且调控DCs和T细胞的相互作用来增强T细胞的功能启动（图1）。
图1. 生物体内DCs的标记及靶向示意图。
在此，研究人员首次将叠氮修饰的甘露糖（Ac4ManAz）作为代谢标记分子用来在体外标记DC2.4细胞。但是，Ac4ManAz在体内使用却存在低水溶性、水凝胶的包装性和释放性差的缺点。为此，在Ac4ManAz的C1位置上修饰丙烯酸酯键，用于连续加成聚会反应得到多聚的叠氮糖（poly (azido-sugar）n，n = 25 (G25) or n = 400 (G400))），并且形成纳米颗粒（图2），通过纳米沉淀法获得的G25和G400 NPs的平均粒径分别是70和130 nm。G25和G400均可以进入并且代谢标记DC2.4细胞和小鼠骨髓树突状细胞（BMDCs）（图3a-c）。
图2. Ac4ManAz的功能化修饰及多聚叠氮糖纳米颗粒的形成。
G400 NP摄取后并不影响BMDCs的激活。与G25 NPs相比，G400 NPs在体外的释放最低（图3d），同时结合叠氮标记效率（图3e）和G400 NPs在体内的超声释放（图3f-g），G400 NPs用于后续研究。
那么负载G400 NPs的凝胶是否能够通过叠氮基团代谢标记DCs并将其聚集到凝胶位点呢？将包含G400 NPs和GM-CSF的凝胶注射到小鼠体内，（表达是不是不清楚）在第3天进行超声处理释放G400 NPs，聚集的DCs达到最大值的时候。在第6天，大量的CD11b+CD11c+DCs标记叠氮基团（图4a-b）。相比之下，少许DCs在缺乏GM-CSF的条件下标记了叠氮基团（图4a-b），支持了聚集DCs和引发G400 NPs在最大细胞积累时的重要性。尽管，G400 NPs没有表现出对DCs标记的优先选择（图4a），但是与其他免疫细胞CD11b+Gr1+细胞（中性粒细胞）和CD11b+F4/80+
图3. 叠氮糖纳米颗粒从凝胶中释放并代谢标记DCs。
细胞（巨噬细胞）相比，成孔海藻酸凝胶主要聚集DCs（图4c）。因此，CD11b+Gr1+细胞和CD11b+F4/80+细胞中仅有很少的标记叠氮（图4c）。
图4. 体内G400 NPs在凝胶中的释放及DCs的代谢标记。
为了研究叠氮标签是否可以追踪DCs，对叠氮标记的DCs凝胶在引流淋巴结（dLNs）和非引流淋巴结（NdLNs）进行量化。所有释放G400 NP的凝胶处理后的小鼠的dLN中均发现叠氮标记的DCs，而将体内含G400 NPs和GM-CSF的凝胶进行超声处理后，dLN中的叠氮标记的DCs数量最多（图4d-e）。此外，在dLN中检测到少许叠氮标记的CD11b+Gr1+细胞和CD11b+F4/80+细胞（图4f）。与其他组相比，共聚焦成像同时发现体内含G400 NPs和GM-CSF的凝胶进行超声处理后，小鼠的dLNs中的叠氮化物含量增多（图4g）。
图5. 叠氮标记的DCs通过点击化学反应介导靶向结合DBCO-分子。
为了探索叠氮标记的DCs的命运，将叠氮标记的免疫细胞进行一段较长时间的监测。从第6天到第14天叠氮标记DCs的百分比在凝胶和dLNs中减少（图4h-i）。从第14天到第21天叠氮标记的DCs的百分比在dLNs中持续不变，同时叠氮标记的巨噬细胞稍有增加（图4i-j）。这是因为由于细胞分裂，导致叠氮的浓度下降，而巨噬细胞增加的原因可能是巨噬细胞和淋巴结中的DCs同时吞噬凋亡的叠氮标记的DCs。
由于三周后叠氮标记的DCs仍存在于dLNs中，因此监测这些叠氮标记的细胞通过点击化学反应介导靶向传递DBCO修饰的分子。具有叠氮标记的DCs的小鼠通过静脉注射DBCO-Cy5，与NdLNs相比，在dLNs中显著增强了Cy5的荧光强度（图5a-b）。初始的荧光比值为2.7±0.8（图5a-b），而注射DBCO-Cy5后的第15天荧光比值为2.3±0.8（图5c-d）。相比之下，注射无G400 NPs的凝胶和PBS溶液的小鼠的dLNs和NdLNs中的荧光没有区别（图5d）。由于DBCO修饰的分子可以以共价结合的方式被细胞表面的叠氮捕获，稳定在细胞表面，因此希望DBCO-细胞因子可以被靶向叠氮标记的DCs提供天然分泌信号和调节T细胞启动（图5e）。虽然细胞因子疗法可能是有效的，但用这些多效性药物以非靶向的方式治疗患者通常会导致严重并发症。叠氮标记的DCs与DBCO修饰细胞因子包括IL-2、IFN-𝛾和IL-15/IL-15Rα的体外结合首次展示（图5f-h）。IL-15/IL-15Rα在抗原呈递细胞表面可以诱导CD8+ T细胞和NK细胞的增殖。进而，研究IL-15/IL-15Rα通过DCs提高CD8+ T细胞的激活和增殖。具有IL-15/IL-15Rα的DCs与OT1细胞共培养在SIINFEKL的存在下，显著地产生pSTAT5表达和OT1细胞的增殖，与没有IL-15/IL-15Rα的DCs相比（图5i）。同时，体内凝胶和dLNs中的叠氮标记的DCs可以捕捉DBCO/Cy5 IL-15/IL-15Rα（图5j-k）。
图6. 叠氮标记的DCs介导靶向DBCO-抗原和DBCO-佐剂的传递，产生有效的细胞免疫响应。
肿瘤抗原和佐剂的靶向给药一直是开发有效的癌症疫苗的关键挑战，所以接下来探索叠氮标记的DCs是否可以在LNs捕获DBCO标记的抗原和佐剂。首次研究叠氮标记的DCs在体内共价捕获DBCO-卵清蛋白（OVA）和DBCO-CpG。通过之前的凝胶处理，小鼠体内LNs内的DCs被叠氮标记，随后静脉注射DBCO/Alexa Fluor647（A647）-OVA或A647-OVA。注射6小时后，与A647-OVA相比，DBCO/Alexa Fluor647在LNs内产生累积（图6a-b）。并且确定在dLNs中的DBCO/Alexa Fluor647组中产生大量的A647-OVA标记的DCs（图6c）。注射后的24或48小时后，dLNs中的叠氮标记的DCs仍然介导靶向传递DBCO/Alexa Fluor647（图6b，d）。在LNs中对于DCs靶向的抗原和佐剂能够成为有效的肿瘤疫苗。为了研究这种可能性，对于之前凝胶处理的小鼠，皮下注射DBCO-OVA/DBCO-CpG，注射后的第8天和第14天，产生大量的OVA特异性的CD8+ T细胞。为了证明DC/LN靶向的肿瘤疫苗系统的潜力，首先研究了E7特异性的CD8+ T细胞放大响应。E7多肽来源于人乳突病毒（HPV）E7肿瘤蛋白。小鼠体内LNs内的DCs被叠氮标记，随后注射DBCO-E7/DBCO-CpG，DC靶向肿瘤疫苗再一次产生大量的E7特异性的CD8+ T细胞和IFN-𝛾+CD8+ T细胞（图6e-h）。在随后的治疗研究中，一种DCs靶向的疫苗有能力根除TC-1肿瘤，并且导致肿瘤生长缓慢和生存率最高（图6i-j）。
该研究提供一种前所未有的体内原位标记DCs，并且调控其在体内与免疫细胞相互作用，有望成为DCs靶向的肿瘤疫苗，治疗肿瘤。
Hua Wang, Miguel C. Sobral, David K. Y. Zhang, Adam N. Cartwright,
Aileen Weiwei Li, Maxence O. Dellacherie, Christina M. Tringides, Sandeep T. Koshy, Kai W. Wucherpfennig and David J. Mooney. Metabolic labeling and targeted modulation of dendritic cells. Nature Materials, DOI: 10.1038/s41563-020-0680-1。
