NAT NANOTECHNOL丨通过整合脂质纳米颗粒-mRNA制剂和树突状细胞疗法来关闭癌症-免疫循环

大家好，今天我要分享的文献发表在Nature Nanotechnology上，题为“Close the cancer–immunity cycle by integrating lipid nanoparticle–mRNA formulations and dendritic cell therapy”。作者从肿瘤免疫循环的角度出发，提出了一种名为CATCH的联合肿瘤免疫治疗方法。该方法有两个方面的作用：首先，通过使用脂质纳米颗粒（LNPs）诱导肿瘤细胞死亡，从而释放肿瘤相关的抗原，增强肿瘤免疫循环；其次，通过激活CD40-CD40L信号通路来激活树突状细胞，使其能够更好地启动肿瘤特异性的T细胞反应。这种联合治疗方法通过结合脂质纳米颗粒-mRNA技术和树突状细胞（DC）免疫疗法，利用CD40-CD40L之间的相互作用来激活BMDCs细胞，重塑肿瘤微环境，消除原发性肿瘤，抑制远端肿瘤的生长，并阻止肿瘤的复发。

通讯作者：俄亥俄州大学药学院董一洲老师

研究方向：开发细胞特异性药物递送系统；构建多功能药物递送系统；探索这些系统在动物模型中治疗遗传疾病、传染病以及癌症的疗效。

研究背景：

为了有效地杀伤肿瘤细胞，抗肿瘤免疫反应需要经历一系列步骤，也被称为免疫循环。首先，肿瘤细胞会释放肿瘤相关抗原（TAA）。然后，这些抗原会被呈递给免疫系统。接下来，T细胞会被激活。一旦激活，T细胞会迁移到肿瘤组织中。随后它们会浸润到肿瘤组织中。然后，T细胞会识别并清除肿瘤细胞。最后，肿瘤抗原的释放完成了一次免疫循环，进一步引发抗肿瘤免疫反应。

然而，肿瘤细胞往往不会坐以待毙。它们会改变自身或者改变周围的微环境，产生免疫抑制效应，例如减少树突状细胞的招募，以逃避免疫系统的攻击。DC 细胞是肿瘤免疫循环中关键的抗原递呈细胞，将经体外工程化改造的DC 细胞重新注射到体内进行肿瘤治疗的方法，称为 DC 细胞疗法。尽管 DC 细胞疗法从许多临床试验中获得了非常重要的安全性和免疫数据，但是，DC 细胞疗法还是无法实现令人满意的抗肿瘤效果。人们发现一些化疗药物与 DC 细胞疗法联用具有协同效应，这些化学药物触发肿瘤细胞死亡，释放出损伤相关的模式分子和肿瘤相关抗原，此过程称为免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death, ICD)。

CD40和CD40配体（CD40L）是一对共刺激分子，树突状细胞（DC）上的CD40和CD4+T细胞上的CD40L之间的相互作用可以促使DC成熟，并进一步促进促炎细胞因子的分泌和共刺激分子的上调。这一过程进一步触发CD8+T细胞产生细胞毒性和记忆反应，起到核心作用。一些CD40激动剂抗体（CD40 Ab）已经在临床试验中进行了研究，结果显示出适度的肿瘤反应率，并且显示出剂量限制毒性。我们试图利用脂质纳米颗粒（LNP）-mRNA制剂整合肿瘤组织中的ICD效应和DC中CD40-CD40L的激活，为DC治疗提供独特的联合治疗。

The Cancer-Immunity Cycle(CIC)

具有高的细胞递送效率的可电离脂质设计与合成

如图1所示，我们成功设计并合成了三组糖醇衍生的可离子化脂质（DIS、DIM和LIS），它们以山梨醇、甘露醇和L-山梨醇为前体。我们制备了含有萤火虫萤光素酶（FLuc）mRNA的脂质纳米粒（FLuc-LNP），并对其大小、表面电荷和mRNA封装效率进行了表征。在所有的脂质纳米粒中，DIM7和LIS10显示出比其他脂质纳米粒更高的mRNA递送效率。通过进一步优化DIM7和LIS10的配方，我们确定了最佳配方DIM7S和LIS10W，它们在mRNA递送效果上表现出优越性。DIM7S和LIS10W的粒径约为110nm，具有良好的分散性和高的mRNA封装效率。这些结果为进一步研究和应用可离子化脂质在基因递送领域提供了重要的参考。

图1 糖醇衍生的可电离脂质的化学合成

图2 LNP–mRNA制剂的筛选、优化和表征

CD40 BMDCs和CD40L LNPs的组合（CATCH方案）可消除肿瘤，抑制远端病变并防止肿瘤再激发

CD40过表达促进了BMDC的激活，尤其在CD40-Ab存在的情况下。通过与PBS、CD40-Ab和CD40-DIM7S治疗相比较，CD40-DIM7S+CD40-Ab刺激了更高水平的DC激活标记物。为了验证激活是否由CD40-CD40L相互作用引起，我们使用CD40-/-BMDC进行了激活实验。结果显示，在CD40-DIM7S处理之前，CD40L-B16F10细胞未能明显激活CD40-/-BMDCs，这表明CD40-BMDCs主要通过CD40-CD40L相互作用进行激活。

为了评估DC的增强激活是否改善体内抗肿瘤作用，我们在B16F10黑色素瘤小鼠模型中进行了多种治疗的i.t.试验（图第3b）。与所有其他治疗相比，CD40-BMDCs+CD40-Ab抑制肿瘤生长5至15倍（接种23 d后；图3c），并延长了总生存时间（图3d）。但所有的老鼠都死亡。然而，与CD40-BMDCs+CD40-Ab相比，CD40-DIM7S+CD40 Ab表现出有限的治疗效果（图3c，d）。在肿瘤组织中，BMDCs+CD40 Ab补充了DC，但抗肿瘤效力仍然弱于CD40 BMDCs+CD40 Ab（图3c，d）。总之，这些结果揭示了过继DC转移、CD40过表达和CD40刺激对CD40-BMDCs+CD40-Ab治疗的抗肿瘤作用的重要性。

尽管CD40-BMDCs+CD40-Ab显示出有希望的抗肿瘤作用，但肿瘤负荷的不完全根除表明有必要进一步增强CIC。具体而言，我们需要寻找方法来提高诱导肿瘤细胞死亡来释放抗原，并激发肿瘤特异性T细胞反应。因此，我们假设通过使用LNPs来诱导免疫细胞死亡（ICD），可以增强CD40 BMDCs的抗肿瘤作用。此外，我们还猜测LNPs介导的CD40L在肿瘤组织中的表达可以激活传递的CD40-BMDCs。因此，我们认为将CD40L LNPs诱导的ICD和传递的CD40-BMDCs组合起来可以协同作用，从而更有效地消除肿瘤。如图3所示，为了验证这些假设，我们在B16F10细胞中评估了含有CD40L mRNA的DIM7S和LIS10W（分别为CD40L-DIM7S、CD40L-LIS10W）的细胞毒性。虽然CD40L-DIM7S和CD40L-LIS10W都导致B16F10细胞中CD40L表达接近100%，但LIS10W LNPs对B16F10细胞的细胞毒性（85%）比DIM7S LNPs（50%）更强。因此，我们选择LIS10W来评估其在B16F10细胞中诱导ICD标记物的能力，与PBS处理相比，FLuc-LIS10W或CD40L-LIS10W在体外诱导的细胞外HMGB1、细胞外ATP和细胞表面钙网蛋白水平分别高出约10倍、7倍和45倍。在体内观察到由FLuc-LIS10W或CD40L-LIS10W诱导的明显ICD效应，进一步证明了LIS10W LNPs在ICD效应中的作用。

图3 DC激活、LNP诱导的ICD以及对原发性肿瘤和再激发性肿瘤的治疗效果

为了评估ICD效应和过继性CD40-BMDC转移的联合抗肿瘤作用，作者先静脉注射CD40-BMDC，然后在18h后静脉注射CD40L-LIS10W（图3g）。该治疗方案的四剂注射导致83%的B16F10荷瘤小鼠的肿瘤完全消退（图3h），其明显高于CD40 BMDCs+CD40 Ab治疗（0%）和CD40L-DIM7S+CD40 BMDCs治疗（17%）。重要的是，CD40L-LIS10W+CD40-BMDCs组中的所有应答小鼠都对对面的B16F10肿瘤再激发具有耐药性（图3i），表明抗肿瘤记忆的发展。这些结果强调了ICD在CIC启动抗肿瘤免疫中的关键作用。为了进一步证实CD40-BMDCs和CD40L介导的活化在该治疗中的作用，我们测试了另外两种治疗方案，包括FLuc-LIS10W+CD40-BMDCs和CD40L-LIS10W+CD40-DIM7S。尽管FLuc-LIS10W（不含CD40L表达的ICD对照）和CD40L-LIS10W在体内显示出相似的ICD效应（图3f），CD40L-LIS10W+CD40-BDMC抑制肿瘤生长约21倍和7倍（接种后19 d）。此外，83%的CD40L-LIS10W+CD40-BDMCs组小鼠在肿瘤接种后存活了45 d而其他两个治疗组的小鼠均未存活（图3k）。此外，在对侧用B16F10细胞再次激发时，100%应答的小鼠对继发性肿瘤发展具有抗性（图3l）。这些发现表明，单独的ICD治疗不足以根除肿瘤病变，强调了DC补充和激活的重要性。

免疫疗法的长期益处需要对抗肿瘤复发的抗肿瘤记忆。因此，我们通过颅内（i.c.）再激发小鼠模型进一步验证了抗肿瘤记忆的发展（图3m）。CATCH治疗实现了原发性皮下肿瘤约88%的完全消退（图3n）。此外，38%的应答小鼠保持无肿瘤，而初始对照组为0%（腹腔注射后75 d再次激发；图3o）。这些数据表明，这种局部治疗产生了强大的抗肿瘤记忆T细胞群。

局部免疫疗法治疗转移性癌症的疗效取决于系统性抗肿瘤免疫组的开发。为了评估这一点，将B16F10细胞接种在每只小鼠的两侧，然后在一个肿瘤部位进行CATCH处理（图4a）。该治疗消除了80%的原发性肿瘤和70%的远端肿瘤（图4b），总生存率约为70%（图4c）。在另一个双肿瘤模型中（皮肤 + 脑瘤），对B16F10-Luc2细胞进行皮下和腹腔接种（图4d）。CATCH治疗根除了80%的皮下肿瘤。同时，该治疗明显使大脑中的肿瘤生长倒退（接种11 d后；图4e），并显著延长了总生存时间（图4f）。总之，这些结果表明这种局部治疗导致了系统性抗肿瘤免疫。

图4  对两种肿瘤或免疫细胞耗竭模型的治疗效果，以及肿瘤组织和血液中细胞因子和趋化因子的动态表达

T细胞介导的癌症细胞杀伤是消除CIC中肿瘤病变的重要步骤。为了评估CD8+和CD4+T细胞对治疗效果的作用，对接受抗CD8、抗CD4或同种型对照Abs的小鼠进行CATCH治疗（图4g）。相对于CATCH治疗，CD8+或CD4+T细胞的耗竭极大地损害了肿瘤消退和小鼠存活（图4h）。特别是，相对于CD4+T细胞的耗竭，CD8+T细胞耗竭导致治疗效果更加显著减弱（图4h）。由于DC是刺激抗肿瘤T细胞反应的关键中介因子，我们利用Batf3^–/–小鼠来检测内源性DC在CATCH治疗中的抗肿瘤作用。尽管与对照组（0%）相比，该治疗提高了存活率（33%）（图4i），这些数据表明内源性和过继转移DC在CATCH治疗中扮演着重要的抗肿瘤角色。

CATCH方案重新编程免疫抑制TME

肿瘤与其微环境密切相关，通过释放细胞信号分子，肿瘤可以影响其微环境。为了研究CATCH治疗后肿瘤微环境的变化，作者观察了小鼠黑色素瘤组织和血液中细胞因子和趋化因子的动态表达。如图4所示，在肿瘤组织中，CD40L-LIS10W引发了29种细胞因子和趋化因子的表达，在6到24小时内达到峰值。此外，静脉注射CD40-BDMC进一步增加了这些因子的浓度。然而，CD40-BDMC的给药在24到42小时内重新刺激了许多细胞因子和趋化因子的产生。这些数据表明，CATCH治疗（CD40L-LIS10W+CD40-BDMCs）可以更好地改变免疫抑制性肿瘤微环境，并引发更强的全身免疫反应。

同时如图5所示，该治疗导致传统的1型和2型树突状细胞（分别为cDC1s和cDC2s）、CD8+T细胞和CD4+T细胞的大量涌入，而减少了肿瘤组织中巨噬细胞和调节性T（Treg）细胞的募集。重要的是，该治疗提高了抗肿瘤表型APC的百分比，包括CD80/86+巨噬细胞和CD80/86+DC。该治疗增强了肿瘤引流淋巴结中巨噬细胞、cDC1s、cDC2s、CD8+T细胞和CD4+T细胞的运输。同时，与初始对照组相比，脾脏和血液中效应记忆和中枢记忆T细胞的数量显著增加，表明长期抗肿瘤免疫的发展。

作者进一步进行了NanoString测定，以量化CATCH治疗后肿瘤浸润免疫细胞中的mRNA水平（图5d，e）。其中，细胞因子和趋化因子相关的转录物（例如，Il12和Ifg）以及炎症反应相关基因（例如，Icam1和Nfkb2）被上调，这与通过Luminex测定测量的细胞因子和化学因子的结果相似（图4k，l）。此外，与肿瘤浸润性免疫细胞的变化一致（图5a），治疗提高了Ptprc（CD45）、Cd247（CD3ζ链）和Cd8b1（CD8β链）的水平，而降低了Adgre1和Siglec1的水平。

图5 免疫细胞浸润、记忆T细胞和mRNA转录组的变化

此外，许多参与抗原呈递的转录物增加，包括MHC II相关的mRNA（H2-DMb2、H2-Ob和H2-Q10)

这些结果证明了CATCH治疗激活肿瘤浸润APC进行TAA呈递和T细胞启动的能力。因此，一些T细胞反应相关的转录增加（图5d，e）。例如，T细胞共刺激分子相关的mRNAs（例如Icos和Cd2）和细胞毒性蛋白相关的mRNA（例如Gzma、Gzmb和Prf1）被上调，表明细胞毒性T细胞分化增强。总体而言，NanoString数据支持CATCH方案诱导的强效抗肿瘤免疫的激活。

CATCH方案的适用性和安全性研究

为了评估CATCH治疗的适用性，作者在另外两个肿瘤模型中测试了抗肿瘤效果。A20和4T1模型的完全应答率分别为83%和50%（图6a–c）。免疫疗法在4T1肿瘤中的完全应答率低于A20肿瘤，我们优化了治疗方案，以减少静脉注射次数。在该治疗方案中，作者共进行了四次i.t.注射，包括两剂CD40L-LIS10W和CD40 BDMC（图6d）。与最初的八次治疗相比，在该优化治疗中观察到类似的完全缓解率（83%）（图6e）。同时，两剂CATCH治疗并没有提高丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和血尿素氮（BUN）的水平（图6f)

为了探索CATCH治疗的临床可转化性，作者测试了DIM7S是否能够有效地将CD40 mRNA递送到人外周血单核细胞衍生的DC中。CD40-DIM7S在这种DC中诱导了约60%的CD40表达，而没有明显的细胞毒性（图6g）。此外，作者还评估了CD40L-LIS10W诱导ICD效应的能力

图6 CATCH治疗方案在其他肿瘤模型和人源细胞中的适用性

在A375人黑色素瘤细胞中。与小鼠B16F10黑色素瘤细胞的结果相似，该治疗增加了CD40L的表达，同时引发了ICD标记物的水平。（图6h）

结论

总之，CATCH治疗通过激活内源性DC和CD40-BMDCs，增强了肿瘤组织中的免疫反应。这导致了多种细胞因子和趋化因子的释放，促进了免疫细胞向肿瘤组织的迁移、效应T细胞的激活和T细胞记忆的形成。因此，CATCH治疗是一种有前景的治疗策略，通过整合LNP-mRNA制剂和DC治疗来改善肿瘤免疫反应。