NAT NANOTECHNOL丨DNA折纸指导的病毒衣壳多态性
大家好，今天给大家分享的是2023年7月发表在Nature Nanotechnology上的“DNA-origami-directed virus capsid polymorphism”。
通讯作者：
Juha T. Huiskonen是赫尔辛基大学生物技术研究所所长、结构生物学教授。OrientLock联合创始人。
Mauri A. Kostiainen教授现任阿尔托大学化学工程学院副教授。他的研究兴趣集中在以一种设计好的方式整合生物和合成构件，以创造生物混合材料。
研究背景：
病毒衣壳可以采用各种几何形状，最典型的特征是二十面体或螺旋对称。重要的是，精确控制病毒衣壳的大小和形状，将有利于开发新的疫苗和递送系统。然而，目前以可编程的方式指导组装过程的工具非常难以捉摸。蛋白质笼可以通过从头设计、对现有蛋白质进行改造或从自然界中分离来制备。非原生类系统已被证明在免疫原展示和有效疫苗设计等方面有效。此外，天然病毒衣壳具有独特的组装特性，使其成为纳米生物工程中流行的构建模块。球形豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)是研究最多的病毒之一。其180个衣壳蛋白 (CP) 拷贝排列成20个六聚体和12个五聚体，形成准二十面体并且为T=3对称。其可逆组装过程具有良好的特征，并且高度依赖于pH值和离子强度等环境条件。由于CP的固有蛋白质组装途径，重新组装会导致六角形片、空球体和管的形成。尽管通过有机和无机材料的封装已经证明了对球形组件的控制，但偏离天然二十面体或管状对称性的其他组件的形成不能以模块化方式实现。鉴于此，芬兰阿尔托大学和赫尔辛基大学研究人员利用DNA折纸模板来精确控制病毒衣壳组件的大小和形状。
实验结果：
1. Forming CP–DNA origami complexes
为此，研究人员通过与短单链staple序列的可编程杂交，将长单链DNA支架链组装成明确的二维和三维结构。首先，他们研究了使用六螺旋束（6HB）DNA折纸引导CCMV CPs的组装。6HB与在天然存在的病毒系统中观察到的DNA包装非常相似。
图1 衣壳包被的DNA折纸结构的形成
研究人员使用了五种不同的DNA折纸结构来研究和控制CCMV CPs组装的特性和可能的几何限制。6HB和24HB是直径分别为6nm和14nm的圆柱形结构，而13螺旋环（13HR）是环形结构，60HB是砖状物体，纳米胶囊是一种刺激响应物体。络合过程由蛋白质-蛋白质相互作用以及 DNA 折纸的带负电荷的磷酸盐主链与蛋白质的26个富含精氨酸残基的N末端区域中带正电荷的氨基酸(aa)残基之间的静电相互作用驱动。 研究发现，络合过程不仅限于单个蛋白质层（灰色），带正电的 CP 残基还与 CP 表面带负电的斑块相互作用，导致第二个蛋白质层（绿色）成核。对起始材料进行表征后，从图1 b和c中可以看到6HB和完整的CCMV负染色在透射电子显微镜 (TEM) 中，被分离的CPs与6HB 的络合是在生理条件下使用过量的CPs进行的。ε被定义为蛋白质单体和DNA折纸之间的摩尔比。使用琼脂糖凝胶电泳(AGE)的电泳迁移率实验（EMSA）来监测络合作用。随着ε的增加，可以看到6HB靠前条带的强度逐渐降低，同时在图1 d中出现了另一个电泳迁移率较低的带，这便是CCMV CPs具有低协同性的快速组装行为。电泳迁移率的下降从ε = 2k 开始停滞，表明折纸与CP复合物的表面负电荷明显减少。 ε = 2k (即6HB-2k)复合样品的负染色TEM图像和SAXS（小角X射线散射）显示，由于高度有序的蛋白质壳，从图1e中可以看到6HB 复合物的直径增加，该壳沿着折纸结构的成核位点发展。当ε > 2k时，从图1 f可以观察到游离CPs在第一蛋白质层顶部的组装，在ε = 10k (即6HB-10k)时尤其明显。对复合结构的直径进行统计分析在图1 g中显示，与无涂层-蓝色相比，单层涂层-灰色和双层涂层-绿色显示出直径逐渐增加的趋势。6HB相当灵活，这可能会导致 CP 初始静电结合时出现部分塌陷的折纸结构，并且容易出现结构缺陷，包括环、弯曲和不完整的层，这也可能解释了6HB-10k更宽的尺寸分布。
对于低离子强度，与蛋白质-蛋白质相互作用相比，蛋白质-DNA折纸的相互作用更强，故建议采用集体机制进行组装。对于6HB-500，虽然涂层的长度和级数是不均匀的，但主要在棒的中部周围观察到成核。相反，当减小纵横比时，在球冠区域也观察到成核。
2. Cryo-electron microscopy reconstruction
图2 用冷冻电镜单粒子重建复杂的6HB结构
为了确认 DNA 的封装和详细的结构表征，研究人员基于冷冻电子显微镜进行了单粒子重建（图2 a、d）。图2 b、e是沿细丝拾取的颗粒进行的二维分类，并仅从记录的图像中获得3D模型的3D细化，在图2 c、f观察到产生了第一蛋白质层分辨率为4.3 Å和第二蛋白质层分辨率为8 Å的螺旋结构。从图2 c右上可以看出蛋白质管由六聚体组装而成，类似于体外组装的HIV病毒形成的管状结构。蛋白质管腔内的密度与封装的DNA折纸相对应（图2g）。其负电荷分布均匀（图2h，左）。面向折纸的N末端为蛋白质管的内表面，其为正静电势表面（图 2h，右下）。相比之下，对于外管表面，负静电势占主导地位（图2h，右上），因此允许形成蛋白质多层复合物。研究人员无法检测到蛋白质层之间或 DNA 和蛋白质之间的特定物理接触点，这表明非特异性静电和蛋白质-蛋白质相互作用是组装的驱动力。蛋白质层的分析显示出螺旋对称性存在明显的差异（图2i），第一层以1起始螺旋，而第二层具有3起始螺旋对称性。
图3 帽状结构的单粒子重建
研究人员发现封闭折纸周围第一CP层的帽状结构是由六个五聚体和一个六聚体组成，进而产生了曲率。六聚体H0仍然遵循螺旋对称性，而六聚体H1则向内倾斜，最有可能与五聚体接触。五聚体P1-P5沿着管轴排列，负责形成帽的主曲率。最后，用第六个五聚体P6密封盖子。
3. Evaluating the template versatility and protection
对于其他测试的DNA折纸结构，图4 a中电泳迁移率的降低证实了DNA折纸与CPs之间的静电相互作用的存在。对于 60HB，与CPs的络合显示出两种不同的状态，而管状的折纸结构在络合后于凝胶中显示出了更渐进的电泳迁移率变化。值得注意的是，这种转变发生在相似的ε值处，与折纸结构无关。在ε = 2.5k时观察到24HB上的单一CP层的完全形成，而第二个CP层需要ε = 10k（图4 b）。与络合的6HB相比，络合的24HB的直径略有增加，并且以1起始螺旋排列的六聚体的螺旋对称性不同（图4 c）。图d通过SAXS确认了络合24HB结构的同次性。这显示了仅CPs和24HB的不同曲线，而络合的24HB的模式明显发生变化。由于60HB的低纵横比（图4 e），可能会形成球壳而不是管，因为60HB的较短边缘与观察到的管外径相对应。研究人员发现60HB的涂层是从折纸结构的方形面发展而来，但只有在大的ε下才观察到完全络合的结构。类似地，对于13HR，完全发展的单层涂层也需要大的ε（图4 f），尽管其横截面大小介于6HB和24HB之间，这表明CPs不能很好地耐受负曲率。图4 g中可以看出沿模板形成管状结构后，看到了明显的弯曲，并导致了络合结构的外观主要为三角形、正方形和五边形。这意味着使模板变形的一系列短的线性拉伸比负曲率更有利于组件形成。
图4 衣壳涂层在不同厚度和形状结构上的适用性
纳米胶囊是一种动态的、受刺激响应的DNA折纸，它可以通过将周围溶液的pH值从8降至6，将其构型从开放变为封闭（图4 h-j）。在pH=6时，当ε≥750时会形成涂层结构（图4 i，j）。与此同时，可以通过添加肝素作为竞争剂来去除涂层，调整pH值将使纳米胶囊恢复到开放状态。此外，研究人员使用金纳米颗粒证明了DNA折纸的高寻址能力，可以通过杂交或嵌入来精确附着各种货物以及靶向分子。众所周知，DNA折纸结构容易受到核酸酶降解的影响，他们发现与CCMV CPs的络合可增强6HB和24HB的稳定性（图4 l），所应用的涂层非常有效，并且在添加终浓度为 5-10% 胎牛血清的细胞培养基中孵育时，也能够保护其结构。
4. Expanding the material toolbox
研究人员基于RNA支架设计了一种6HB RNA-DNA混合折纸结构，图5 b、c、d中 的AGE以及原子力显微镜(AFM)和TEM结果表明了结构的成功折叠，包括荧光团的整合。图5 e中RNA-6HB与CPs的络合导致电泳迁移率降低，并且长度和直径都发生了变化，从普通结构的直径到涂层结构的直径，与络合的6HB DNA折纸结构类似，呈现出增加的趋势。
图5 模板材料和病毒CPs的变化
该方法的多功能性是通过测试三种不同的CPs来进行评估，即使用诺如病毒GII.4(NoV)、猴病毒40(SV40)和鼠多瘤病毒(MPyV)的VP1s来进行涂层覆盖，所有使用的病毒种类都具有多态性行为。研究人员为了使NoV的VP1蛋白进行模板化，将6HB与病毒样颗粒 (VLPs) 混合并转移到碱性pH中。但是，TEM主要显示普通的6HB折纸，而无法检测到以折纸为模板的蛋白结构，很有可能是VP1上缺乏带正电荷的N端RNA结合域。相比之下，VLP 分解后获得的24HB与SV40壳粒的络合产生了高度有序的涂层。与空管相比，在24HB上模板化组装时观察到管直径的增加，管长度部分有差异。对于多瘤病毒MPyV，使用DNA折纸，完全涂覆的结构显示出较窄的长度和直径分布。
结论：
综上所述，本文开发了一种策略，以精确和可编程的方式在生理条件下指导病毒衣壳的组装。通过使用通用的DNA折纸作为模板，可以实现对所形成组件的大小和形状的精确控制。
