NAT NANOTECHNOL丨用DNA折纸组装的多功能T细胞连接器
大家好！今天我要和大家分享一篇发表在Nature Nanotechnology上的最新研究论文，它的题目是《Programmable multispecific DNA-origami-based T-cell engagers》。这篇论文的作者是Sebastian Kobold、Jonas J. Funke和Hendrik Dietz。其中，Hendrik Dietz教授的主要研究方向是利用DNA折纸技术来制造具有精细功能的分子设备和分子机器。
背景
目前，T细胞免疫疗法的临床试验正在如火如荼地开展。在其中，双特异性抗体等药物已经显示出可以延长患者的生存期。提高靶标抗原的数量可提高对靶细胞的治疗特异性，减轻免疫治疗脱靶效应带来的副作用，并有益于减少单一抗原导致的对阴性细胞的遗漏杀伤。然而，多特异性抗体的制备受到重构抗体结构域的空间几何排列受限的影响。
为此，本文作者利用DNA纳米连接载体，将IgG抗体ab段-IgG(ab)等用模块化程序化的方式装载起来，从而将靶细胞与T细胞拉近，激活T细胞并发挥T细胞对靶细胞的杀伤裂解作用。这种作用已在体内外得到了验证。
结果
- IgG-PTEs组装 （Fig.1）
在这项研究中，作者通过优化组装条件，将自定义的IgG抗体组装在DNA折纸上。优化的条件包括抗体和DNA折纸结合的方向（抗体DNA标签的5'端或3'端与DNA折纸连接）、位置和数量，以及修饰有抗体的DNA折纸在细胞表面被内吞的情况。作者准备了带有DNA标签的抗体库，选择了CD3、CD28和CD137这三种可以激活T细胞的抗体，并选择了CD19、CLL-1、CD22和CD123这四种靶细胞抗原。通过凝胶迁移实验验证了抗体和DNA折纸的成功组装，并通过条带灰度计算了组装效率，达到了85-97%。
接下来，作者使用T细胞活化核因子荧光报告实验（NFAT）来评估程序化组装T细胞连接器-programmable T-cell engager (PTE)诱导的T细胞活化。首先作者将CD19+、CD22+、CD123-和CLL-1-NALM-6 ALL细胞和转导NFAT荧光素酶的Jurkat细胞共同培养。在去除仅有T细胞抗体（CD3 CD28）引起的T细胞活化后，作者发现CD19×CD3诱导的T细胞活化程度要高于CD22，这个结果与以往报道的实验结果一致。而aCLL-1和aCD123×aCD3 PTE并没有引发T细胞活化。双特异性抗体PTE的T细胞活化作用要比单抗更强。
Fig. 1 | Production and functional screening of 105 unique antibody combinations on a DNA chassis.
- 体外验证Fab-PTEs的功能特征（Fig.2）
双特异性抗体可以介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。在这项研究中，作者初步探究了DNA折纸底座的大小和修饰Fab的分布对靶细胞杀伤的影响。完整结构的IgG在T细胞治疗中存在局限性，因为抗体的Fc段可能被多种免疫细胞识别，导致不被希望出现的细胞间相互作用，从而导致非特异性细胞裂解。此外，Fab表位的分布也会影响PTEs对T细胞的激活作用和对靶细胞的杀伤作用。考虑到这些因素，作者设计了更小的DNA折纸底座（20.0×15.0×7.5 nm3）。基于这个设计，作者应用了4种已知的人抗原和1种鼠抗原。首先，作者将CD19+ NALM-6细胞与人外周血单个核细胞（PBMC）共同培养，通过流式细胞术观察到PTEs对NALM-6细胞的浓度依赖性裂解作用，而CD3或CD19单抗的PTEs则未观察到杀伤效果。同时，通过分析CD69的表达水平，可以判断CD8 T细胞的活化情况。另外，其他几种抗原（huCD33、huEpCAM、huPSMA和muCD19）的PTEs在低摩尔浓度下也表现出较好的细胞裂解作用。通过活细胞成像，可以观察到基于双特异性抗体的PTEs介导下，T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
Fig. 2 | Programmable T-cell-mediated killing of target cells
- PTEs的生物分布（Fig.3）
为了确保在生理性低离子浓度条件下，PTEs的结构和抗降解性能得到保持，作者使用了PER-寡赖氨酸包被PTEs。经过3个月在4°C保存的实验，PTEs的结构完整性和功能性都得到了良好的保留。为了检测PTEs在免疫缺陷小鼠体内的分布情况，作者使用了活体内时间分辨荧光成像技术。小鼠通过静脉注射DNA折纸底座或者PTEs，注射后的2.5小时内每隔30秒进行一次CY7荧光检测。除了溶剂组（PBS），其他组都显示出快速的荧光增加。大约注射5分钟后，所有组都在肝脏出现了荧光累积，而其他组的荧光在膀胱区域出现的速度比PTEs组更快。随后，通过解剖并获取小鼠脏器，发现CY7信号出现在多个脏器，而PTEs主要通过胆道和肾脏系统排泄出体外。
Fig. 3 | In vivo characterization of DNA-origami-based T-cell engager.
- PTEs在活体内的特性（Fig.4）
为了评估PTEs在活体组织中的作用过程，作者将NALM-6-GFP-luciferase细胞注入NSG小鼠体内，然后注射PBMC效应细胞，并最后注射PTEs、Blina-BS和溶剂组。在注射后的4小时进行流式细胞术检测。结果显示，注入含CD19 F(ab)抗体组的GFP+ NALM-6细胞的CY7荧光增加，而且当靶细胞与CD19抗体结合时，PTEs组和Blina-BS CD19位点占据率分别为76%和99%。总之，这个活体实验证明PTEs可以在活体内持续作用至少4小时。正如在体外实验中证实的，DNA纳米载体通过与效应细胞靶细胞的正交结合，发挥了招募和激活T细胞的作用。为了证实PTEs在活体内的T细胞激活机制，作者通过定量CD69早期活化T细胞标志物的表达来评估T细胞的活化情况。相较于对照组，Blina-BS和PTE-2×19-3均明显诱导了CD4+和CD8+ T细胞的CD69表达。因此，可以说PTEs在活体内结合NALM-6靶细胞并激活了T细胞。
随后，作者研究了PTEs是否可以在活体内控制NALM-6移植瘤的生长。使用NALM-6-GFP细胞作者进行了模型构建。首先，作者设置了3个PTEs的工作浓度（300、100和30 pmol），并设置了对照组、PTE-3单阳组、溶剂组（PBS）和阳性对照组Blina-BS，观察了6天。首先，生物发光成像（BLI）显示PTEs组和阳性对照组的绿色荧光明显下降，流式细胞术数据也显示PTEs组明显降低了肿瘤负担，并且PTEs的作用具有明显的剂量效应。为了确定最佳的CD3单克隆抗体，作者还使用UCHT1进行了类似的验证实验，结果显示基于OKT3的PTE-2×19-3组的效果与Blina-BS组没有差异。而UCHT1组则出现了剂量依赖的T细胞耗竭。作者还进行了更长的治疗时间（21天）的尝试，结果显示PTEs组的效果接近Blina-BS组。
Fig. 4 | Investigation of functionality of DNA-origami-based T-cell engagers in vivo
总结
作者利用DNA折纸技术精确排列多种特异性抗体，通过体内外实验证明了其功能。他们组装了105种多特异性抗体变体，可以用于识别多种靶细胞位点并激活T细胞。然而，作者设计的PTEs仍需要更高的工作浓度才能达到与其他治疗方法相似的效果。这种差异可能是因为DNA折纸上的F(ab)位置没有放置在最佳位置，以确保T细胞的招募和对靶细胞的杀伤。此外，通过组合CD3和CD28单克隆抗体，可以提高T细胞的活化效率。总之，PTEs在体内外都展现出良好的表现。
