ANGEW丨具有抗钩子效应的纳米蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 用于肿瘤治疗

今天分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.的文章，题目为“Nano Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) with Anti-Hook Effect for Tumor Therapy”，通讯作者是国家纳米科学中心的王浩教授，其主要研究方向是染料分子的自组装及其光学行为。

蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)技术是目前最有效的靶向蛋白降解技术之一，其通过介导泛素-蛋白酶体系统在翻译后水平消除感兴趣蛋白。PROTAC诱导的异位泛素化依赖于三元复合物(即E3连接酶/PROTAC分子/POI)的形成，其中蛋白-蛋白相互作用是由两个蛋白招募元件通过中间的化学连接而实现的。然而，三元配合物的形成伴随着不可避免的熵惩罚，导致在高浓度下广泛存在“钩状效应”，即无效的二元复合物(E3连接酶/PROTAC分子或PROTAC分子/POI)占据主导地位。并且由于有限的细胞通透性，PROTACs的临床转化依旧困难。因此，开发一种具有高效细胞摄取和内在“反钩效应”的通用平台对PROTACs的设计和构建至关重要。

人工拓扑纳米结构(ATN)具有显著的表面效应和多价特性，基于ATN的PROTACs是一种实用的生物技术，通过构建有效的多聚复合物[(E3)_m: PROTAC:(POI)_n]来抵消"钩状效应"，克服传统小分子PROTACs在体内有效性降低的问题。此外，原位激活的基于ATN的PROTACs可进一步弥补传统PROTACs在肿瘤治疗中严重的组织脱靶效应。作者在2015年首次报道了动物体内多肽的原位自组装，不仅可以通过刺激响应和配体-受体相互作用实现形态学上的调节，而且可以促进剂量依赖性的组装和富集，为实现特异性诊断和治疗提供了结构基础。在此基础上，作者报告了一种细胞内组装的Nano-PROTACs系统，该系统是一个中心E3连接酶位点-辐状POI位点的降解网络，具有在体外和体内实现剂量依赖性和长效降解的潜能(图1)。具体来说，Nano-PROTACs系统由独立的两个亲水性组装肽组成，分别具有招募POI和E3连接酶的功能。在癌细胞中高水平的谷胱甘肽（GSH）刺激下，这两种前体可以通过点击反应特异性地结合成驱动组装的单体，从而在胞内形成长程有序的β-片层纳米结构，POIs和E3连接酶可以与暴露在高度有序Nano-PROTACs表面的多个配体结合，从而形成具有组织滞留效应的多元纳米复合材料。

图1: 原位自组装Nano-PROTACs的示意图：

Nano-PROTAC系统由两个基于肽的前体P_POI和P_E3组成，它们包含四个相似的结构域:

• POI配体或E3连接酶招募配体；

• GHK-Cu^II, Cu^II可以在肿瘤细胞中被高水平的GSH特异性还原为Cu^I作为点击反应的催化位点；

• azido或alkyne基团作为点击反应位点；

• 组装驱动肽GNNQQNY，一个亲水的β-片层形成肽域。

首先，作者使用了由P_EGFR(带有炔基)和P_VHL(带有叠氮基)形成的Nano-PROTAC_EGFR系统来研究这种原位组装过程(图2b,c)。GHK-Cu^II可被GSH还原成GHK-Cu^I从而驱动P_VHL的叠氮基和P_EGFR的炔基之间的点击反应。对GSH的催化行为作者通过一个模型反应来评估：在含有Coumarin 1和P_EGFR的溶液中加入GSH后，由于Coumarin 1中的迭氮基和P_EGFR中的炔基发生了内电荷转移反应生成具有荧光的Coumarin 1，荧光强度在60分钟内呈指数增长；而在GSH缺失时，荧光无明显变化(图3)。通过标准ThT测定法研究了在GSH存在或不存在的情况下P_EGFR和P_VHL的自组装动力学，结果显示在GSH存在下半完成时间(t_1/2= 4.6 h)显著短于无GSH组(t_1/2= 15.7 h)（图2d）。原子力显微镜图像（图2e）显示Nano-PROTAC_EGFR组装成螺旋状纤维结构，其中螺距高度为48±5 nm(图2f)，组装的高度约为3.0nm。接着通过广角x射线散射进一步研究了Nano-PROTAC_EGFR中肽骨架的自组装模式（图2g），在4.9 Å处的强反射峰表明该组件采用了β-片层结构。13.8 Å处的宽峰为Nano-PROTAC_EGFR的分子内间距。

图2: Nano-PROTACs构象和模块化设计。

图3: GSH激活的点击反应模拟模型

PROTAC与POI和E3连接酶的三元协同复合物是POI有效泛素化和进一步降解POI的基础。通过微尺度热电泳(MST)确定了P_EGFR与EGFR蛋白的结合亲和力为0.95 μM, P_VHL与VHL蛋白的结合亲和力为4.26 μM。EGFR和VHL与Nano-PROTAC_EGFR的结合亲和力分别为0.78 μM和4.34 μM，验证了组装后的Nano-PROTAC_EGFR表现出比未组装的P_EGFR和P_VHL更高的结合亲和力(图4a-d)。接着作者利用MST探索了EGFR和VHL在这种多元纳米复合材料中的化学计量学。在多元纳米复合物中，EGFR: VHL的化学计量学计算为2:1(图4e,f)。根据MST的结果，作者通过AutoDock 4软件对Nano-PROTAC_EGFR与VHL/EGFR蛋白的结合模式进行了模拟(图4g)。选择两个EGFR胞内结构域和一个VHL蛋白与具有良好构象的八聚体Nano-PROTACEGFR的配体模拟。结果显示多元络合物呈现了VHL中心-辐条降解网络模型，其化学计量学为EGFR: VHL=2: 1，为POI泛素化和降解提供了结构基础，EGFR和VHL的多重结合可以形成一个中心-辐条的降解网络。

图4：多元纳米复合物(EGFR: Nano-PROTAC_EGFR: VHL)的形成。

在溶液中确认EGFR: Nano-PROTAC_EGFR: VHL多元纳米复合物后，作者进一步评估了其特异性的细胞内自组装行为、蛋白结合能力和多聚复合物的形成。NBD标记的Nano-PROTAC_EGFR组装体与Cy5标记的EGFR蛋白或VHL蛋白之间的共定位分析评估了Nano-PROTAC_EGFR与EGFR和VHL的结合(图5a)。Nano-PROTAC_EGFR的NBD荧光和蛋白质的Cy5荧光(EGFR，图5b左;VHL，图5b右)重合，表明了多元氟、复合物的有效形成。接下来，作者通过质粒转染eGFP编码的EGFR和DsRED编码的VHL来评估蛋白的募集(图5d)。在CLSM图像中的共定位显示Nano-PROTAC_EGFR可以介导VHL和EGFR之间的相互作用(图5e右)。这些结果共同证实了Nano-PROTAC_EGFR能够有效募集EGFR和VHL构建稳定的多聚复合物。

图5：Nano-PROTACs在体外的自组装，蛋白结合和降解。

接着，作者使用两个不同的POIs（EGFR和AR）来评估蛋白质的降解效果。如图5f所示，EGFR/AR和VHL被Nano- PROTACs募集形成稳定的多元络合物，进一步诱导EGFR/AR的长效降解，并且具有“抗钩效应”。Nano-PROTAC_EGFR被用于评估EGFR蛋白的剂量依赖性和长效降解。Nano-PROTAC_EGFR的IC50为28.1 μM，显著低于单体P_VHL (116.7 μM)和P_EGFR (66.5 μM)(图5g)。接着，通过流式细胞术(图5h)和免疫印迹(图5i)验证了EGFR的降解。与PBS、P_VHL和P_EGFR相比，Nano- PROTAC_EGFR对EGFR有着显著降解。使用蛋白酶体抑制剂MG132后，EGFR未见明显降解(图5i)，证实Nano-PROTAC_EGFR的泛素化降解机制。Nano-PROTAC_EGFR降解EGFR具有长达到72小时的效果(图5j)，并且具有“抗钩效应”(图3k,l)。为了进一步验证Nano-PROTACs设计策略的普适性，作者选择了前列腺癌的核心驱动和治疗靶点AR作为另一个POI来评估其治疗潜力（图5m-r），具有与Nano-PROTAC_EGFR相同的治疗效果。综上所述，组装诱导的"防钩"效应和滞留有助于在较宽的浓度范围内延长体外降解时间，为体内治疗效果评价提供了依据。

Nano-PROTACs富集和保留的体内评估

在评估体内治疗效果之前，作者先对Nano-PROTAC的肿瘤富集效果进行了评估，将Cy7标记的P_VHL、P_EGFR和Nano-PROTAC_EGFR分别静脉注射到A549 ^{EGFR +}荷瘤小鼠体内，通过活体荧光成像观察Nano-PROTACs的成瘤时间，评价Nano-PROTACs在体内的生物分布。如图6a所示，注射的Nano-PROTAC_EGFR在0.5 h内在肿瘤部位迅速聚集，然后持续富集到4 h并保留到72 h。肿瘤荧光定量分析显示，与P_VHL和P_EGFR相比，Nano-PROTAC_EGFR的特异性荧光滞留延长(图6b)。此外，生物电镜在肿瘤组织中检测到成束的纳米纤维，进一步证实了Nano-PROTAC_EGFR在体内的自组装(图6c)。Nano-PROTAC_EGFR的荧光呈剂量依赖性聚集在肿瘤部位(图6d)，这与体外评估的肿瘤组织Nano-PROTAC_EGFR荧光信号一致(图6e)。从定量分析来看(图6f)，Nano-PROTAC_EGFR主要在肿瘤组织中富集并持续存在，并且与注射剂量有很好的直线拟合。综上所述，Nano-PROTAC_EGFR可以通过体内自组装实现剂量依赖性的肿瘤富集和长时间滞留。

图6：Nano-PROTAC_EGFR富集和滞留的体内评估

Nano-PROTAC_EGFR降解系统的体内抗肿瘤效果

作者在A549 ^EGFR+荷瘤小鼠模型中评估了Nano-PROTAC_EGFR的治疗效果。结果表明，与PBS, P_EGFR 或P_VHL 治疗组相比，Nano-PROTAC_EGFR显示出显著的剂量依赖性肿瘤抑制效果(图7b-e)。在确认Nano-PROTACs策略的有效性后，作者评估了蛋白质的降解状态，与其他组相比，Nano-PROTAC_EGFR处理的肿瘤组织的EGFR表达显著降低（图7f-g）。此外，在Nano-PROTAC_EGFR处理后，通过TUNEL检测到明显的凋亡信号(图7h)。这些结果共同证实了Nano-PROTAC_EGFR降解系统在抗肿瘤应用中的有效性。

为了进一步研究体内组装诱导的“抗钩效应”，作者还在Hela ^(EGFR+)宫颈癌小鼠模型中研究了剂量依赖性的治疗效果。Nano-PROTAC_EGFR治疗显示出剂量依赖性的肿瘤抑制效果(图7i)，并且未观察到明显的体重下降(图7j)，表明Nano-PROTAC_EGFR的治疗窗高且毒性最小。此外，作者利用免疫荧光证实了EGFR的剂量依赖性降解(图7k)，这进一步证明了Nano-PROTAC_EGFR在体内的“抗钩效应”。

图7：Nano-PROTAC_EGFR的体内抗肿瘤疗效

Nano-PROTAC_AR降解系统的体内抗肿瘤作用

性激素受体（AR）是前列腺癌等疾病的主要治疗靶点。作者成功构建了LNCap (AR+)荷瘤小鼠模型来评估Nano-PROTAC_AR降解系统的抗肿瘤效果。与对照组相比，Nano-PROTAC_AR治疗抑制了肿瘤生长(图8b)。Nano-PROTACAR治疗组小鼠的中位生存时间较PBS、P_AR和P_VHL治疗组显著增强，这与肿瘤生长结果有很好的相关性(图8c)。此外，在治疗20天后没有检测到明显的体重下降(图8d)，表明Nano-PROTAC_AR降解系统的毒性很小。更重要的是，在LNCap荷瘤小鼠中施用三种剂量Nano-PROTACAR后观察到剂量依赖性治疗作用(图8e)。为了进一步证实Nano-PROTACAR的有效肿瘤抑制是由于AR的降解，作者通过western blot评估了肿瘤组织的AR表达(图8f)。这些结果证明了Nano-PROTAC_AR降解系统在体内抑制前列腺癌肿瘤的可行性。HE染色结果和血液生化数据分析结果在PBS和Nano-PROTAC_AR治疗组之间无明显差异(图8g-k)，提示Nano-PROTAC_AR的毒性可忽略不计。上述结果表明，Nano-PROTAC_AR降解体系具有良好的生物相容性和治疗应用前景。

图8：Nano-PROTAC_AR的体内抗肿瘤疗效

综上所述，作者报告了一种细胞间制备的纳米- PROTACs系统，该系统中点击反应可被肿瘤细胞中高水平的GSH特异性激活。Nano-PROTACs在体内外均可实现POIs的长效和剂量依赖性降解，进而抑制肿瘤生长。Nano-PROTACs首次引入了一种肿瘤特异性的细胞内制造策略，通过E3连接酶和POI结合形成一个中心辐状降解网络，在克服传统PROTACs的脱靶副作用和“钩状效应”方面具有巨大的潜力。Nano- PROTACs为精确构建PROTACs提供了一个可推广的平台，为未来PROTACs的临床转化应用提供了一种有前景的模式。