NAT CHEM丨一种高维微流方法用以可编程结合亲和力的核酸适体筛选
大家好，今天分享的文献为2023年6月发表在Nature Chemistry上的《A high-dimensional microfluidic approach for selection of aptamers with programmable binding affinities》，通讯作者是来自多伦多大学生物化学，制药科学，化学和生物医学工程的莎娜·凯利教授，她的主要研究方向是：开发用于测量生物活性的新型分子和设备。项目涉及不同学科的各个方面，从生物分子化学，分子生物学和细胞生物学到材料科学，生物医学工程和纳米技术等。
Shana O. Kelley（莎娜·凯利）
背景
精确控制生物分子之间的结合亲和力是自然界中数千种生物分子在拥挤的环境中能够在分子水平上控制协同工作的关键之一。对特定靶标具有明确结合亲和力的分子，即所谓的亲和力试剂，在许多应用中也是必不可少的，包括生物传感、诊断、成像和治疗等。另一方面，具有快速缔合和解离速率的低亲和力试剂由于可以解决目标分析物水平的动态变化而被用于实时监测应用。因此，为了满足不同传感场景的不同要求，非常希望能够产生对特定靶标具有结合亲和力的识别分子。
在过去的三十年里，核酸适体作为多功能亲和试剂和抗体有前途的替代品，引起了人们的极大兴趣。近年来，适体在实时监测和传感应用中显示出巨大的潜力。与抗体相比，适体提供了几个独特的特征，包括高稳定性、紧凑的尺寸、成本效益高、变异率低、非免疫原性特性和易于对位点进行特异性化学修饰等。虽然适体具有诸多的优势特征，但是其在生物传感中的应用依然相对有限。其中一个原因是许多生物分子靶标缺乏高质量适体。通过SELEX常规程序来进行适体筛选的是劳动密集型且耗时的，并且不能产生具有可编程结合亲和力的适体。典型的SELEX实验需要10至15轮选择才能使目标序列充满核酸库。这种低效是由于传统的SELEX无法在每一轮中分离出具有不同结合亲和力的适体候选者，以及引入了不期望的偏差，如由于反复选择带来的聚合酶链式反应（PCR）偏差和寄生序列的扩增等。这些因素还使得所选适体的结合亲和力不可预测，需要测试许多序列来鉴定适体的特性。
为了改进序列的分配效率，最近也出现了许多新型SELEX技术，如CE-SELEX、Non-SELEX、M-SELEX和粒子显示选择技术等。然而，这些方法中没有一种能够定量地产生具有可定义结合亲和力的适体。本研究设计了一种新的方法，称为Pro SELEX，用于定量分离具有可编程结合亲和力的适体。本研究的工作流程包括粒子显示、磁性粒子排序、高维和并行选择以及高内涵的生物信息学。使用该工作流程，能够在单轮选择中对不同靶浓度的个体适体候选物的结合性能进行分析。为了验证该方法，本研究筛选得到了人髓过氧化物酶（MPO）的特异性适体，MPO是一种新出现的冠状动脉疾病诊断和预后生物标志物。
结果与讨论
- Pro SELEX筛选平台的开发
为了测量核酸文库中每个适体序列的相对亲和力，粒子显示技术可通过乳液PCR将基于溶液的适体文库中的单个适体候选转化为单克隆AP，其中每个粒子在其表面上呈现单个核酸序列的多拷贝（图1a）。然后将AP文库与一定浓度范围内的特定靶标进行孵育。基于Langmuir等温线，AP的靶标结合水平取决于靶标浓度和涂覆在其表面的适体的结合亲和力，其中当靶标浓度等于适体的Kd时，一半的适体分子将与靶标结合。随后可以使用高分辨率微流体分选方法分离和收集具有不同结合水平的AP，最后进行测序分析，基于它们在不同靶浓度下的结合性能来鉴定具有不同结合亲和力的适体。
图1. 通过高维微流控方法定量分离具有不同结合亲和力的核酸适配体。
为了准确地划分具有不同靶结合水平的AP，开发了一种磁性标记和微流体分选方法（图1b）。使用聚苯乙烯颗粒（直径7µm）来制备AP，在AP与生物素化靶标孵育后，用抗生物素磁性纳米颗粒（MNPs，直径50nm）标记颗粒，从而将靶标结合率转化为磁性大小。然后使用微流体装置（Pro SELEX芯片）对标记的混合物进行分选。该设备具有四个具有不同线速度的捕获区，以便对不同磁含量水平的AP进行差分分选。由于MNP的低磁化率，每个捕获区都包含微加工结构，以产生低流速的局部区域和增强的捕获动力学。1区表现出最高的线速度，因为磁力克服了由高流速施加的阻力，从而保留了具有高磁性含量的AP。随后的三个区域显示出逐渐降低的线速度（图1d）。这种设计能根据AP的目标结合水平的不同从而在相应区域中进行分离和捕获AP。本研究证明了Pro SELEX芯片能够根据颗粒的磁性含量对颗粒进行分类（图1e）。值得注意的是，Pro SELEX芯片的磁分离的严格性和分辨率可以通过调整芯片流速来编程（图1e）。
- Pro SELEX芯片分选性能的验证
本研究使用凝血酶适体作为测试案例来验证该方法（图2a）。首先测试了Pro-SELEX芯片是否可以对具有不同靶标结合水平的AP进行分类。将凝血酶-03适体包被的颗粒（03颗粒）与从1 pM到1 nM浓度范围的凝血酶进行孵育，然后用MNP来标记（图2b）。随后，使用Pro SELEX芯片以8 mL·h-1和16 mL·h-1的流速对颗粒进行分选，并生成独特的分选曲线（图2c，d）。具有高磁性含量（1 nM和100 pM）的颗粒主要以8 ml·h-1的流速捕获在芯片的1区中，并在将流速增加到16 ml·h-1时部分转移到2区，而具有较低磁性含量的颗粒主要收集在后面的区域中，并且在废物中检测到几乎所有的非靶向结合颗粒。这一观察结果表明，Pro SELEX芯片能够根据AP的目标结合水平对其进行分类和捕获，采用几种流速对分类剖面进行分层。接下来，本研究探讨了Pro-SELEX方法是否可以分离具有不同结合亲和力的AP。制备了两种类型的AP，分别是凝血酶-03适体（Kd=7.04pM）和凝血酶TBA适体（Kd=2.6nM）。用三种凝血酶浓度测试两种AP以及包被引物的颗粒，并使用流式细胞术（图2e–g）和Pro SELEX芯片（图2h–j）进行分析。当使用1µM的凝血酶浓度时，远大于两种适体的Kd，两种AP都被靶标饱和，并在芯片的1区被捕获。当目标浓度降至1nM时，观察到明显的分离，使得高亲和力03颗粒保留在1区中，而低亲和力TBA颗粒在2区和3区中被检测到。当目标浓度进一步降低到1pM时，大部分TBA颗粒被收集在废液中，而03颗粒中的相当一部分仍然被捕获在芯片中。值得注意的是，无论凝血酶浓度如何，芯片在8 ml·h-1的流速下捕获的包被引物的颗粒不到0.5%，这表明Pro SELEX芯片具有高捕获特异性。总之，这些结果表明，Pro-SELEX芯片能够以独特的结合亲和力分离AP，其中靶浓度在决定分离效率方面发挥着重要作用。
图2. 使用具有不同结合亲和力的抗凝血酶适配体验证Pro-SELEX芯片的分选性能
- 使用Pro SELEX筛选MPO适体
接下来，本研究探讨了是否可以使用Pro SELEX来有效地产生适体。选择MPO作为模型目标来测试Pro SELEX筛选适体的能力。首先对含有~1×1014个随机DNA分子的初始随机DNA文库进行预富集步骤，该步骤包括三轮针对不希望靶标的反选择和针对MPO固定化珠的常规SELEX，以去除非特异性结合物并减少文库的序列空间。然后将富集的文库用作模板，通过乳液PCR制备AP文库。在五种MPO浓度（10pM、100pM、1nM、10nM和100nM）下测试AP文库用以分离Kd在此范围内的适体，确保MPO分子在靶标孵育过程中过量。然后通过Pro SELEX芯片以两种流速（16 ml·h-1和32 ml·h-1）对AP文库进行分类（图3a）。Pro SELEX芯片对5×107个AP进行排序所需时间不到20分钟，这比基于FACS的排序方法更快。然后收集十个芯片内每个区域捕获的颗粒（图3b、c）。正如预期的那样，能够清楚地观察到Pro SELEX芯片捕获的AP的分数随着目标浓度的降低而降低，并且当使用更快的流速时，AP库的排序发生了变化，这突出了该方法的高分辨率。
图3. 通过基于高维微流控的方法分离具有不同结合亲和力的抗MPO适配体。
从每个芯片的1-3区收集的颗粒以及未分类的适体群体共有31个DNA库，随后进行高通量测序（HTS）。为此还创建了一个评分工具AptaZ，该工具用于全面分析来自30个DNA库的每个适体候选物的富集倍数，并生成Z评分。能够在多种目标浓度下，特别是在两种流速下的低浓度下存在，并被芯片重复捕获的适体候选物将产生高的Z分数（图3e）。随机选择具有不同Z评分的八个MPO适体候选MPO-01至MPO-08进行表征。所有八种适体均表现出对MPO的亲和力，Kd值范围为227pM至27.8nM（图3f）。在八个候选的Kd值和基于曲线拟合计算的Z分数之间存在线性关系（图3g），表明使用Z分数进行适体筛选是具有潜力的。
- 具有所需亲和力的MPO适体的定量筛选
接下来，本研究探讨了Z评分是否可以用于定量筛选具有所需结合亲和力的适体。基于经验证的MPO适体的Z分数和Kd值之间的相关性生成搜索带（图4a）。将所需的Kd值设置为1000 pM、3000 pM、9000 pM和27000 pM，并根据搜索带计算其理论Z得分范围。选择该范围内的适体候选者，并检查其结合亲和力，计算其实验Kd和所需Kd之间的差异，将小于25%的差异定义为“非常适合”。
图4. 根据Z评分定量分离具有所需亲和力的抗MPO适配体。
通过评估不同Z评分范围内的多种MPO适体候选物的结合亲和力，发现识别“非常适合”的成功率在20%至50%之间，这表明通过在Z评分范围内测试每五种适体候选体就能够鉴定出一种具有所需结合亲和力的适体（图4b）。所需亲和力的“最佳拟合”对象是Kd为897 pM的MPO-14、Kd为3192 pM的MPO-18、Kd的8778 pM的MPO-25和Kd为24910 pM的MPO-34（图4c）。测试的适体的Kd值跨越了100倍以上，其中MPO-16显示出最高的结合亲和力（Kd=166 pM）。据报道，健康中年人群的正常MPO水平<640 pM，较高的MPO水平与心血管疾病风险增加有关。因此本文报道的具有不同结合亲和力的MPO适体将成为未来MPO监测应用中有价值的工具。
结论
本研究开发了一种适体产生方法Pro-SELEX，它能够有效和定量地产生具有所需结合亲和力的适体。可以在单轮选择中监测不同靶浓度的单个适体候选物的结合性能，并利用了高维微流体实现的高水平并行化。Pro SELEX方法也是高度可编程的，通过调节颗粒尺寸、流速以及底物浓度等可以轻松定制以适应各种其他应用。
