Nat Biomed Eng. 丨一种基于 Cas12 的单锅等温检测方法，用于 microRNA 的灵敏检测
大家好，今天分享一篇发表在nature biomedical engineering上的文章，题目为A one-pot isothermal Cas12-based assay for the sensitive detection of microRNAs。
本文的通讯作者是美国佛罗里达大学的Yong Zeng教授，课题组的主要研究集中在分析科学与工程、细胞外囊泡、生物医学糖蛋白组学与糖组学、和液体活检。
背景：
miRNA是内源性的非编码单链RNA。由于miRNA参与细胞增殖、分化和细胞死亡等多种生物学过程，因此，miRNA的失调与癌症等疾病的发病机制密切相关。针对miRNA的研究最初是在组织中进行的，但它们也存在于血液、尿液和其他体液中，并与核糖核蛋白复合物或argonaute-2有关，或被包裹在外泌体中。因此，在基于液体活检的癌症诊断、预后和监测中检测循环miRNA是一种很有前途的策略。然而，尽管这一方向前景光明，但从概念验证到临床实践仍处于研究阶段。由于miRNA长度短、序列相似性高、在不同细胞类型和生物液体中的浓度范围大，因此在生物标本中高效检测miRNA仍面临挑战。
最近，CRISPR技术已经成为开发下一代生物传感器的通用工具，已经报道的多种用于DNA和病毒RNA检测的CRISPR分析方法通常需要额外的PCR或等温预扩增步骤才能达到理想的检测灵敏度。遵循相同的策略，通过各种等温反应（包括RCA、LAMP和级联扩增）预先扩增miRNA靶标，研究人员也开发了不同的基于CRISPR的miRNA检测方法。然而，这些方法涉及单独的预扩增和CRISPR介导的读取步骤，需要多步手动操作，这不仅导致复杂的分析工作流程，而且还增加了由于人为错误、酶降解和交叉污染而导致的误差。值得注意的是，大多数现有的基于CRISPR的方法都利用了Cas蛋白的反式切割活性，而对特定的顺式切割活性（CRISPR-Cas系统用于基因编辑的主要机制）的探索在很大程度上仍未开发。
本文报道了一种一步、一锅等温CRISPR-Cas12a检测方法，命名为EXTRA-CRISPR（图1），并将其用于快速、特异性检测miRNA，其灵敏度与RT-PCR相当。EXTRA-CRISPR与现有的基于CRISPR的生物传感方法有四个主要区别。首先，它代表了一种同时利用CRISPR-Cas12a系统的顺式切割和反式切割活性的策略。除了利用反式切割反应实现扩增子检测和信号扩增外，它还利用特定的顺式切割活性来转化传统的线性RCA，以实现目标序列的指数扩增。其次，通过模块化挂锁探针，该方法将靶物介导的连接、RCA、Cas12a结合和酶切等多个反应整合到一个协同耦合的反应网络中，创建了一个强大的一步、一锅等温miRNA分析方法。第三，这种一锅等温miRNA分析方法提供了与标准RT-qPCR相当的分析性能。最后，EXTRA-CRISPR技术极大地简化了分析工作流程，不需要专门的仪器，为POC诊断提供了一种适应性强的模式。
图1：EXTRA-CRISPR的原理图
结果：
首先，研究人员以miRNA 21为模型靶物研究了EXTRA-CRISPR的反应机制（图2），发现当miRNA 21浓度从1 pM增加到10 pM时，EXTRA-CRISPR的荧光强度随之增加，而当继续增加miRNA 21浓度时（100 pM和1 nM），EXTRA-CRISPR的荧光强度随之下降，这主要是因为高浓度的miRNA 21会在短时间内产生大量的RCA单链产物。相较于信号报告基团，被激活的cas12a优先通过反式酶切活性切割RCA单链产物，从而抑制EXTRA-CRISPR的信号。而当RCA单链产物的量远少于信号报告基团时，被激活的cas12a的反式酶切活性可以消化信号报告基团，而顺式酶切活性可以将RCA的长的单链产物切割成长的或短的片段，这些片段中含有RCA的引物链序列，并且长片段引发RCA的能力要远远弱于短片段（图2i）。
图2：EXTRA-CRISPR的反应机制研究。
接下来，研究人员利用结扎辅助RCA、串联RCA、CRISPR以及EXTRA-CRISPR在相同反应条件下检测miR-21。发现EXTRA-CRISPR具有最快的检测速度和最低的灵敏度。经过对EXTRA-CRISPR反应体系中挂锁探针序列设计和浓度、连接酶种类、样品前处理步骤（退火与否）、phi29 DNA聚合酶和信号报告基团的浓度等条件做了优化（图3），实现了对miR-21的灵敏检测（单碱基特异性，检测限低至fM）。除了在溶液中验证EXTRA-CRISPR的分析性能外，研究人员还利用EXTRA-CRISPR对胰腺癌相关的miRNA进行检测，并结合机器学习的方式实现了对胰腺癌的诊断。
图3：EXTRA-CRISPR的分析性能研究。
最后，研究人员将EXTRA-CRISPR与基于POC检测的系统结合起来设计了不同的POC检测平台，分别为基于智能手机的EXTRA-CRISPR系统和基于试纸条的EXTRA-CRISPR-LFA（图4）。作为临床应用的概念验证，作者评估了基于智能手机的POC设备对从胰腺癌患者和健康人血浆样本中分离的不同miRNA的检测能力，发现POC设备能够检测到不同miRNA的差异，因此能够区分胰腺癌患者与健康人，这与qPCR的检测结果一致。然而EXTRA-CRISPR-LFA受试纸条分析性能的限制，其对不同miRNA的检测能力较差，但仍然能够区分胰腺癌患者与健康人。
图4：EXTRA-CRISPR在POC检测中的应用。
总结
总的来说，EXTRA-CRISPR具有操作简单、反应快速和成本低的特点，并且在对生物和临床样品中miRNA分析时具有与标准RT-qPCR相媲美的能力。该方法的简单性将极大地促进其与POC检测的结合，以满足不同的临床应用。原则上，在核酸适配体的辅助下，可以将基于CRISPR的等温扩增技术作为一种通用工具，应用于蛋白质和小分子等其他类型生物标志物的传感器的开发中。
