JACS丨VEGF分泌驱动的肿瘤细胞选择性膜受体聚集以用于体内治疗
大家好，今天给大家分享的文献是今年2月份发表在JACS上面的题为《Cancer Cell-Selective Membrane Receptor Clustering Driven by VEGF Secretion for In Vivo Therapy》的一篇文章。本篇文章通讯作者是南京大学的刘颖教授，刘颖教授课题组主要研究方向为：（1）智能响应纳米材料合成与光学性能优化。（2）生物分析与传感、智能响应的细胞成像与近红外二区活体成像。（3）药物智能递送与疾病/癌症精准诊疗策略开发。
研究背景：
细胞膜表面受体聚集
细胞可以感知细胞外基质的纳米尺度特征并产生功能变化，选择性的受体-配体识别是激活细胞功能和决定细胞命运的第一步。细胞表面受体的空间分布控制细胞信号级联反应和细胞行为，已知许多细胞行为（例如细胞粘附，扩散，生长和迁移）受细胞表面受体聚集的调节。
细胞表面受体聚集是受体间距的纳米尺度变化，因此纳米材料在精确操纵受体的空间结构方面具有巨大的应用前景。由于DNA具有通过序列定向杂交形成可编程结构的能力，它已成为纳米结构制造的强大材料。功能性的DNA纳米结构，例如DNA折纸，DNA适体，和DNAzyme，可以作为构建纳米结构的基石，以控制细胞表面受体的聚集。
整体设计：
图1：膜受体选择性聚集在Raji细胞上的SMARC策略
本篇文章主要设计了一种针对CD20、可选择性调控Raji淋巴瘤细胞受体聚集(SMARC)策略，将具有重复发夹结构单元的可伸缩型DNA纳米串锚定在细胞膜CD20上，其能够响应Raji细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）而发生收缩，使得CD20受体发生聚集。
具体设计分为2部分：（1）通过DNA链S、H和H2的杂交链组装，合成扩展构型的DNA纳米串（EDNS）。DNA链H包含两个片段，一个“直”片段与S杂交以构建纳米链骨架，另一个“发夹”片段与H2杂交以将纳米链拉伸成“延伸”构型。为了将EDNS锚定在Raji细胞膜上，还将其与CD20抗体缀合的DNA链（H3-CD20）杂交以获得CD20抗体偶联的DNA纳米链（EDNS-CD20）（图1A）。（2）VEGF放大器由双链DNA链IS-AptVEGF和DNA链H1、IS和DNA纳米串之间的循环反应组成。IS-AptVEGF识别并与Raji细胞分泌的VEGF结合，并释放DNA链IS，IS随后与链H1杂交以展开其发夹结构，所获得的IS-H1复合体作为DNA纳米串构型变化的触发器，IS-H1和H2之间的发生链置换反应将H2从DNA纳米串中拉离，从而恢复H的发夹结构，并将DNA纳米串转化为收缩构型（CDNS）。H1−H2双链作为反应产物产生，同时释放游离的IS以完成循环反应，再生的IS与H1杂交多个反应周期放大了VEGF的响应，并引起有效的DNA纳米链收缩，最终导致细胞膜上的CD20受体聚集（图1B）。同时，VEGF与AptVEGF结合而失活，从而阻止VEGFR的激活，也有助于肿瘤治疗。经研究表明，SMARC策略对Raji细胞具有选择性和高效的促凋亡作用，且对正常B细胞干扰小，可实现良好的体内治疗效果。
结果与讨论：
1 DNA纳米串 EDNS的合成和VEGF响应性构型变化的表征
图2：EDNS合成和VEGF响应性构型变化
作者通过DNA链H、S和H2杂交合成了DNA纳米串EDNS（图2A），聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）显示出迁移率低得多的新条带，表征了EDNS的成功合成（图2B，泳道4）。原子力显微镜（AFM）图像显示高度为~1.5nm的线性DNA长链出现，这与双链DNA的高度相对应，进一步证实了EDNS的成功生成（图2C）。由于EDNS和CDNS在PAGE中表现出相似的迁移率，因此使用在3`端用TAMRA标记的DNA链S及其在5`末端的相应猝灭剂BHQ2（TAMRA-S-BHQ2）来合成用于区分EDNS和CDNS的DNA纳米链，并通过监测TAMRA荧光来验证DNA纳米串的构型变化（图2D）。所获得的EDNST/B显示出明显的TAMRA荧光，而CDNST/B几乎没有显示出荧光（图2E）。同时证实，DNA纳米链的收缩程度与VEGF浓度成正比（图2F）。
2 EDNS-CD20的合成及VEGF响应性收缩的表征
图3：EDNS-CD20的合成及VEGF响应性收缩
为了将EDNS锚定在Raji细胞膜上，用巯基修饰的DNA链H3（H3-SH）与马来酰亚胺修饰的CD20抗体（抗CD20-Mal）缀合，然后将得到的H3-CD20与EDNS杂交以获得EDNS-CD20。为了验证H3-CD20与EDNS的结合，将H3-CD20-FAM与EDNS-TAMRA杂交，同时将FAM和TAMRA设计为具有邻近位置，以在获得的EDNST-CD20F中实现荧光共振能量转移（FRET）证实EDNS-CD20的成功构建（图3A）。EDNST-CD20与Raji细胞孵育，在细胞膜周围清楚地显示出TAMRA荧光，流式细胞术发现有明显迁移，这表明EDNST-CD20在细胞膜上的特异性和有效锚定。为验证DNA纳米链在细胞膜上的收缩，FITC标记的CD20与EDNST/B杂交生成EDNST/B-CD20F，与Raji细胞在IS-AptVEGF和H1的存在下孵育，TAMRA荧光显著降低，表明DNA纳米串收缩；FITC在细胞膜上并非均匀荧光，表明CD20的聚集（图3B，C）。正常淋巴B细胞也在细胞膜上表达CD20，但分泌的VEGF要少得多，将EDNST/B-CD20F与正常淋巴B细胞孵育，在细胞膜上显示出明显的FITC荧光，表明DNA纳米串成功锚定，且显示出TAMRA荧光的非常有限的降低，FITC荧光几乎没有聚集（图3C）。对TAMRA与FITC荧光强度比值分析，以定量比较不同处理对应的DNA纳米链收缩，发现Raji细胞的荧光比值显著降低，表示DNA纳米串主要在Raji细胞表面收缩（图3D）。因此，SMARC策略通过VEGF放大器在操纵膜受体聚集时对肿瘤细胞有特异性，对正常细胞几乎干扰较小。
3 CD20聚集的影响与细胞凋亡
图4：CD20聚集与细胞凋亡
CD20单体是一种缓慢内化的膜受体，CD20受体的聚集改变了其从循环到溶酶体降解的内吞途径。将EDNS-CD20A与Raji细胞孵育，发现细胞膜上APC荧光的显著降低，细胞内APC荧光和LysoTracker共定位，这种有效的溶酶体积累证实了CD20受体的聚集（图4A）。有研究表明，CD20在细胞膜上有效聚集导致细胞外Ca2+内流，引起细胞凋亡，故作者使用Ca2+内流检测探针Fluo-4 AM证实Ca2+内流的成功启动，这进一步反映了CD20的聚集（图4B）。通过流式细胞术监测CD20聚集引起的细胞凋亡，经EDNS-CD20处理后，引起了75.2%的Raji细胞凋亡，对照处理均对细胞活力无影响，MTT实验进一步证实了上述结果（图4C，D）。
4 SMARC策略的体内抗肿瘤作用
图5：SMARC策略的体内抗肿瘤作用
为将SMARC应用于体内治疗，采用P-DNAs作为ENDS纳米链的合成组分，提高其抵抗核酸外切酶降解的稳定性；Cy5及其相应的猝灭剂BHQ3分别标记在P-S链的3`端和5`端，以表征体内DNA纳米链的收缩。选择携带Raji的小鼠作为体内模型，静脉注射P-EDNSC/B-CD20，肿瘤位置的荧光猝灭证实了体内DNA纳米链的有效收缩，肿瘤生长体积也明显减小（图5B，E）。TUNEL和H&E染色图像显示大量的凋亡细胞，进一步证实了SMARC策略良好的体内治疗效率（图5F，G）。
结论：
总的来说，作者开发了一种细胞膜受体聚集调控策略 ，将具有重复发夹结构的可伸缩型DNA纳米串锚定在细胞膜CD20上，其能够响应Raji细胞分泌的VEGF而发生收缩，使得CD20受体发生聚集；该策略对Raji淋巴瘤细胞具有选择性和高效的促凋亡作用，且对正常B细胞干扰小，可实现良好的体内治疗效果。
