韩 达 课 题 组

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ANGEW丨树枝化 DNA 嵌合体利用清道夫受体降解细胞膜蛋白

今天分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.的文章,题目为“Dendronized DNA Chimeras Harness Scavenger Receptors To Degrade Cell Membrane Proteins”。通讯作者是南京大学化学与生物医学创新中心的李金波教授,其课题组的主要研究方向是核酸化学生物学和基因治疗。在这篇文章中,作者提出了一种树突状DNA嵌合体(DENTAC)策略,该策略利用清道夫受体进行靶向膜蛋白降解,包括POI结合分子与树突状DNA。

蛋白靶向降解通过降解难成药蛋白为癌症治疗创造了新的思路。蛋白靶向降解嵌合体(PROTAC)主要对细胞质蛋白进行降解,而大多数膜蛋白仍然是“不可成药”的靶点。为了克服这一困境,溶酶体靶向嵌合体(LYTACs)被提出作为降解膜蛋白的有效策略。LYTACs系统包括溶酶体转运受体(LTRs)配体和POI结合分子,其中LTR目前包括甘露糖-6-磷酸受体、具有肝脏特异性的去唾液酸蛋白受体和整合素等。

清道夫受体(SRs)是巨噬细胞表面的一组异质性分子,此类受体多见于巨噬细胞表面,它们以化学修饰的蛋白质、多核苷酸、多糖和磷脂等为配体并可促进其胞吞作用,起着清除体内有毒物质以及衰老、凋亡或坏死细胞的作用,主要为SR-A和SR-B。SRs作为阴离子配体结合受体被用于DNA纳米相关的细胞递送。聚阴离子DNA纳米材料能够靶向SRs,然后通过小泡介导的内吞作用沿着核内体-溶酶体途径内化。基于SRs在癌细胞上具有高的丰度,已有多个研究通过设计核酸纳米器件靶向SRs用于治疗药物的细胞内传递和化学报告基因的溶酶体靶向传递。在此,作者报告了一种树突状DNA嵌合体(DENTAC)策略,该策略利用SRs进行靶向膜蛋白降解,包括POI结合分子与树突状DNA(方案a)。

方案:DENTAC系统设计示意图(aDENTACSRs结合的DNA树突和POI结合分子组成,利用细胞表面的SRs,将膜目标蛋白运输到溶酶体中进行蛋白降解;b:聚胸腺嘧啶DNA树突(PTDD)与POI结合剂偶联形成DENTAC的合成策略。)

共价分枝DNA具有稳定的化学结构,可作为靶向SR的配体。作者使用固相合成的方法合成了一个具有三个T10分支和一个T10茎的多胸腺嘧啶DNA树突(PTDD)。在茎端用DBCO修饰后,PTDD可以通过CLick反应叠氮修饰的POI分子偶联,得到DENTAC嵌合体(方案b)。

首先,作者以IgG为模型POI验证IgG靶向DENTAC能通过内化进入活细胞。通过DNA电泳验证PTDD与抗IgG抗体偶联形成I- DENTAC,然后用Alexa fluor-647标记的IgG(IgG-647)和抗IgG抗体或I-DENTAC共同孵育A549细胞。与单独抗IgG抗体相比,I-DENTAC孵育后细胞荧光持续增强(1b),这表明I-DENTAC能够介导细胞特异和有效的摄取IgG。内化过程会被过量的PTDD甲基化牛血清白蛋白(mBSA)SRs抑制剂阻止(图2),说明内吞作用依赖于PTDD-清道夫受体的相互作用。共聚焦荧光成像进一步显示,在I-DENTAC处理后,IgG-647与溶酶体(LysoTracker染色)共定位(1c),表明I-DENTAC细胞摄取后会转运到溶酶体。

1I-DENTACIgG的内化和溶酶体转运。

 

2I-DENTACA549细胞结合测定

接着作者验证了DENTAC是否能降解膜相关癌蛋白,选择在癌细胞膜上过表达并发挥致瘤作用的核仁素(NCL)作为示范性靶点,通过将PTDD对膜NCL具有高亲和力和特异性的DNA适体AS1411进行偶联,合成了NCL靶向的DENTAC (N-DENTAC)。N-DENTAC有效地与A549细胞结合,其平衡解离常数(Kd)为69.5±8.9 nM(3),强于PTDD (Kd = 121.5±11.2 nM)和AS1411 (Kd = 129.5±8.3 nM)。此外,N-DENTAC在生理条件下表现出较高的稳定性。

 

3N-DENTAC的表征和其与A549细胞结合测定

作者通过多种方法验证了N-DENTAC对细胞膜上NCL的降解效果:1、用N-DENTAC处理A549细胞,流式结果显示N-DENTAC以剂量依赖的方式去除细胞表面的NCL,其半最大降解浓度为25 nM(4b),最大降解率为60%(4c);2、通过共聚焦荧光成像监测N-DENTAC介导的膜NCL的减少,仅在N-DENTAC处理后观察到信号减弱(4d);3、Western blot结果显示N-DENTAC可使膜NCL水平降低68%(4e);4、用定量质谱进一步对N-DENTAC或AS1411处理过的A549细胞进行全蛋白质组分析(5),N-DENTAC能显著降低膜NCL水平,而AS1411对NCL水平没有影响。此外,N-DENTAC还介导了人宫颈癌HeLa细胞、乳腺癌MCF-7细胞和肝细胞癌HepG2细胞中膜NCL的降解(图6),表明其具有广泛的适用性。这些数据共同验证了N-DENTAC降解膜NCL的能力。

4N-DENTAC降解细胞膜核仁素的能力

5 N-DENTACAS1411处理的A549细胞的全蛋白质组分析

 

6 N-DENTACHeLaMCF-7HepG2细胞系中对细胞膜蛋白的降解效果;

之后,作者探讨了N-DENTAC的降解机理。使用10倍浓度的PTDD/AS1411或mBSA与N-DENTAC共同处理细胞,发现相比与单独N-DENTAC,共同孵育后N-DENTAC不能降解NCL,说明其降解依赖于配体-受体的相互作用(7a);通过将SR-A1/3~6(8)、SR-B2受体(7b)使用siRNA进行敲降后,发现SR-A1基因敲降后对N-DENTAC的抑制作用最为明显;蛋白酶体途径抑制剂(MG132)和溶酶体途径(巴弗洛霉素A1)抑制剂实验结果显示N-DENTAC降解膜蛋白依赖于溶酶体途径(7c

7N-DENTAC的蛋白质降解机制。

 

8SR-A1, SR-A3~6分别敲减后对N-DENTAC降解细胞核仁素效果的影响。

鉴于细胞膜NCL的致瘤作用,作者最终检测了N-DENTAC的抗癌活性。CCK-8试验显示N-DENTAC和AS1411在处理96 h后分别抑制A549细胞增殖62%和41%(9),表明N-DENTAC具有抗癌活性。基于此,作者使用小鼠皮下A549成瘤模型进行了体内研究(10a)。当肿瘤大小达到60 mm3时,每2天以相同剂量(2mg/kg)在瘤内注射AS1411或N-DENTAC。14天后,生理盐水组、AS1411组和N-DENTAC组的肿瘤体积分别增加到528 mm3、283 mm3和127 mm310b)。相对于生理盐水组AS1411和N- DENTAC组肿瘤重量分别降低了30%和76%(10d)。这些结果表明N-DENTAC在肿瘤抑制方面比AS1411更有效,降解NCL比阻断NCL效果更好。

9 N-DENTACA549细胞活性和ERK信号通路的影响

Western blot和免疫组化分析均显示N-DENTAC组的肿瘤组织中NCL显著减少(10e/f),证实N-DENTAC能够在体内降解NCL。HE和TUNEL染色显示N-DENTAC组中凋亡细胞数量显著高于AS1411组(10f)。Ki67的免疫组化检测也显示N-DENTAC抗增殖作用强于AS1411(10f)。这些数据与体内抗癌结果一致,证明了DENTAC介导膜蛋白降解的治疗优势。

10 N-DENTAC的体内抗癌活性。

总结作者开发了DENTAC平台,使SRs介导的膜蛋白降解能够有效地治疗癌症。DENTAC以下几个优点:首先,DENTAC是模块化和通用的。替代蛋白配体可用于扩大可靶向空间。E-DENTAC使用西妥昔单抗作为蛋白结合剂降解A549细胞上的表皮生长因子受体(EGFR)(11)。其次,SRs的高表达和广泛分布使DENTAC成为现有膜蛋白降解技术的补充,广泛适用于各种生物和疾病相关的环境。第三,有效和持久的蛋白质降解使DENTAC进一步的药理用途。

11 E-DENTAC系统降解细胞膜EGFR受体

2023年3月13日 22:13
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