ANGEW丨树枝化 DNA 嵌合体利用清道夫受体降解细胞膜蛋白
今天分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.的文章，题目为“Dendronized DNA Chimeras Harness Scavenger Receptors To Degrade Cell Membrane Proteins”。通讯作者是南京大学化学与生物医学创新中心的李金波教授，其课题组的主要研究方向是核酸化学生物学和基因治疗。在这篇文章中，作者提出了一种树突状DNA嵌合体（DENTAC）策略，该策略利用清道夫受体进行靶向膜蛋白降解，包括POI结合分子与树突状DNA。
蛋白靶向降解通过降解难成药蛋白为癌症治疗创造了新的思路。蛋白靶向降解嵌合体（PROTAC）主要对细胞质蛋白进行降解，而大多数膜蛋白仍然是“不可成药”的靶点。为了克服这一困境，溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）被提出作为降解膜蛋白的有效策略。LYTACs系统包括溶酶体转运受体（LTRs）配体和POI结合分子，其中LTR目前包括甘露糖-6-磷酸受体、具有肝脏特异性的去唾液酸蛋白受体和整合素等。
清道夫受体（SRs）是巨噬细胞表面的一组异质性分子，此类受体多见于巨噬细胞表面，它们以化学修饰的蛋白质、多核苷酸、多糖和磷脂等为配体并可促进其胞吞作用，起着清除体内有毒物质以及衰老、凋亡或坏死细胞的作用，主要为SR-A和SR-B。SRs作为阴离子配体结合受体被用于DNA纳米相关的细胞递送。聚阴离子DNA纳米材料能够靶向SRs，然后通过小泡介导的内吞作用沿着核内体-溶酶体途径内化。基于SRs在癌细胞上具有高的丰度，已有多个研究通过设计核酸纳米器件靶向SRs用于治疗药物的细胞内传递和化学报告基因的溶酶体靶向传递。在此，作者报告了一种树突状DNA嵌合体（DENTAC）策略，该策略利用SRs进行靶向膜蛋白降解，包括POI结合分子与树突状DNA（方案a）。
方案：DENTAC系统设计示意图（a：DENTAC由SRs结合的DNA树突和POI结合分子组成，利用细胞表面的SRs，将膜目标蛋白运输到溶酶体中进行蛋白降解；b：聚胸腺嘧啶DNA树突（PTDD）与POI结合剂偶联形成DENTAC的合成策略。）
共价分枝DNA具有稳定的化学结构，可作为靶向SR的配体。作者使用固相合成的方法合成了一个具有三个T10分支和一个T10茎的多胸腺嘧啶DNA树突（PTDD）。在茎端用DBCO修饰后，PTDD可以通过CLick反应与叠氮修饰的POI分子偶联，得到DENTAC嵌合体（方案b）。
首先，作者以IgG做为模型POI验证IgG靶向的DENTAC能通过内化进入活细胞。通过DNA电泳验证PTDD与抗IgG抗体偶联形成I- DENTAC，然后用Alexa fluor-647标记的IgG（IgG-647）和抗IgG抗体或I-DENTAC共同孵育A549细胞。与单独抗IgG抗体相比，I-DENTAC孵育后细胞荧光持续增强（图1b），这表明I-DENTAC能够介导细胞特异和有效的摄取IgG。内化过程会被过量的PTDD、甲基化牛血清白蛋白（mBSA）或SRs抑制剂阻止（图2），说明内吞作用依赖于PTDD-清道夫受体的相互作用。共聚焦荧光成像进一步显示，在I-DENTAC处理后，IgG-647与溶酶体（LysoTracker染色）共定位（图1c），表明I-DENTAC被细胞摄取后会转运到溶酶体。
图1：I-DENTAC对IgG的内化和溶酶体转运。
图2：I-DENTAC与A549细胞结合测定
接着作者验证了DENTAC是否能降解膜相关癌蛋白，选择在癌细胞膜上过表达并发挥致瘤作用的核仁素（NCL）作为示范性靶点，通过将PTDD与对膜NCL具有高亲和力和特异性的DNA适体AS1411进行偶联，合成了NCL靶向的DENTAC （N-DENTAC）。N-DENTAC能有效地与A549细胞结合，其平衡解离常数（Kd）为69.5±8.9 nM（图3），强于PTDD （Kd = 121.5±11.2 nM）和AS1411 （Kd = 129.5±8.3 nM）。此外，N-DENTAC在生理条件下表现出较高的稳定性。
图3：N-DENTAC的表征和其与A549细胞结合测定
作者通过多种方法验证了N-DENTAC对细胞膜上NCL的降解效果：1、用N-DENTAC处理A549细胞，流式结果显示N-DENTAC以剂量依赖的方式去除细胞表面的NCL，其半最大降解浓度为25 nM（图4b），最大降解率约为60%（图4c）；2、通过共聚焦荧光成像监测N-DENTAC介导的膜NCL的减少，仅在N-DENTAC处理后观察到信号减弱（图4d）；3、Western blot结果显示N-DENTAC可使膜NCL水平降低68%（图4e）；4、用定量质谱进一步对N-DENTAC或AS1411处理过的A549细胞进行全蛋白质组分析（图5），N-DENTAC能显著降低膜NCL水平，而AS1411对NCL水平没有影响。此外，N-DENTAC还介导了人宫颈癌HeLa细胞、乳腺癌MCF-7细胞和肝细胞癌HepG2细胞中膜NCL的降解（图6），表明其具有广泛的适用性。这些数据共同验证了N-DENTAC降解膜NCL的能力。
图4：N-DENTAC降解细胞膜核仁素的能力。
图5 N-DENTAC或AS1411处理的A549细胞的全蛋白质组分析
图6 N-DENTAC在HeLa、MCF-7、HepG2细胞系中对细胞膜蛋白的降解效果；
之后，作者探讨了N-DENTAC的降解机理。使用10倍浓度的PTDD/AS1411或mBSA与N-DENTAC共同处理细胞，发现相比与单独N-DENTAC，共同孵育后的N-DENTAC不能降解NCL，说明其降解依赖于配体-受体的相互作用（图7a）；通过将SR-A1/3～6（图8）、SR-B2受体（图7b）使用siRNA进行敲降后，发现SR-A1基因敲降后对N-DENTAC的抑制作用最为明显；蛋白酶体途径抑制剂（MG132）和溶酶体途径（巴弗洛霉素A1）抑制剂实验结果显示N-DENTAC降解膜蛋白依赖于溶酶体途径（图7c）。
图7：N-DENTAC的蛋白质降解机制。
图8：SR-A1, SR-A3~6分别敲减后对N-DENTAC降解细胞核仁素效果的影响。
鉴于细胞膜NCL的致瘤作用，作者最终检测了N-DENTAC的抗癌活性。CCK-8试验显示N-DENTAC和AS1411在处理96 h后分别抑制A549细胞增殖62%和41%（图9），表明N-DENTAC具有抗癌活性。基于此，作者使用小鼠皮下A549成瘤模型进行了体内研究（图10a）。当肿瘤大小达到60 mm3时，每2天以相同剂量（2mg/kg）在瘤内注射AS1411或N-DENTAC。14天后，生理盐水组、AS1411组和N-DENTAC组的肿瘤体积分别增加到528 mm3、283 mm3和127 mm3（图10b）。相对于生理盐水组，AS1411和N- DENTAC组肿瘤重量分别降低了30%和76%（图10d）。这些结果表明N-DENTAC在肿瘤抑制方面比AS1411更有效，降解NCL比阻断NCL效果更好。
图9 N-DENTAC对A549细胞活性和ERK信号通路的影响
Western blot和免疫组化分析均显示N-DENTAC组的肿瘤组织中NCL显著减少（图10e/f），证实了N-DENTAC能够在体内降解膜NCL。HE和TUNEL染色显示N-DENTAC组中凋亡细胞数量显著高于AS1411组（图10f）。Ki67的免疫组化检测也显示N-DENTAC抗增殖作用强于AS1411（图10f）。这些数据与体内抗癌结果一致，证明了DENTAC介导膜蛋白降解的治疗优势。
图10 N-DENTAC的体内抗癌活性。
总结，作者开发了DENTAC平台，使SRs介导的膜蛋白降解能够有效地治疗癌症。DENTAC有以下几个优点：首先，DENTAC是模块化和通用的。替代蛋白配体可用于扩大可靶向空间。E-DENTAC使用西妥昔单抗作为蛋白结合剂降解A549细胞上的表皮生长因子受体（EGFR）（图11）。其次，SRs的高表达和广泛分布使DENTAC成为现有膜蛋白降解技术的补充，广泛适用于各种生物和疾病相关的环境。第三，有效和持久的蛋白质降解使DENTAC有进一步的药理用途。
图11 E-DENTAC系统降解细胞膜EGFR受体
