Nat Commun丨对无细胞转录组的全面表征揭示了用于癌症检测的组织和亚型特异性生物标志物
今天分享的文献是发表在 Nature Communications上的一篇文章，标题为“ A comprehensive characterization of the cell-free transcriptome reveals tissue- and subtype-specific biomarkers for cancer detection ”。
有关作者：
本文的通讯作者是 Larson, Matthew H.，目前担任GRAIL公司的高级研发总监，主要研究方向是利用下一代测序、人群规模临床研究以及最先进的计算机科学和数据科学以开发开创性技术实现早发现早识别早治疗多种致命癌症。
研究背景：
癌症早期诊断可显著提高存活率，近年来，大量研究集中于cf DNA在癌症筛查中的潜力。肿瘤来源的游离DNA ( cell-free DNA，cf DNA )由Mandel和Metais于1947年发现，作为癌症检测的有效生物标志物，已被用于检测实体器官移植后的组织排异、妊娠期间无创产前检测和肿瘤早期诊断，以及早期鉴别多种癌症类型和基因分型等。目前测序成本低，文库制备技术高效，使得癌症相关的点突变、拷贝数变异和甲基化标记在疾病检测中越来越早。但早期体积较小或生长缓慢的肿瘤向循环系统中释放的DNA量较少，导致肿瘤分数低，早期癌症检测敏感性低，且多数cfDNA无组织特异性导致得在阳性筛选的癌症患者中很难预测肿瘤组织来源，对检测技术的灵敏度以及候选位点的选取都是不小的考验，使利用其预测癌症患者肿瘤组织来源变得困难。
与cfDNA相比，肿瘤来源的游离RNA ( cell-free RNA，cf RNA )作为癌症标志物有以下3个优势：敏感性和功能性，组织特异性可追溯疾病发生的组织来源，低成本更利于早筛早诊普及。肿瘤特异性转录本的过度表达会使血液中肿瘤源性RNA信号的扩增，为肿瘤脱落率较低的患者提供了癌症检测的机会。之前cf RNA的研究主要集中在微小RNA ( microRNA，miRNA )，然而，由于其对基因调控的多效性而难以解释以及分析前处理条件、定量策略和批次效应会使cfRNA水平发生偏移，导致缺乏可重复性、可解释性低和特异性差，很少转化为临床实践。相比之下，癌症相关信使RNA ( mRNA )有更多的临床应用，但仅限于检测已知的致癌mRNA标志物，但并未解决cf RNA在癌症筛查中的潜在应用。
在本研究中，作者表征cf RNA，鉴定乳腺癌和肺癌患者特异性的无细胞转录组生物标志物，并在避免来自循环血细胞的混杂背景噪声的同时，开发了一种从患者血浆中保存、提取和测序胞外mRNA的策略，且用来自无细胞基因组图谱研究( CCGA , NCT02889978)的癌症和非癌症参与者血液中的cfRNA进行了转录组分析对该方法进行了验证。总之，揭示了无细胞mRNA可作为检测和定位癌症生物标志物的潜力，并为识别不同癌症中高度特异性的生物标志物提供了框架。
结果与讨论：
- cfRNA特征分析
为建立在患者血浆中保存cfRNA的可重复方案，作者系统评估分析前参数对cfRNA含量和表达谱的影响，并选择93个年龄匹配的非癌症个体用于表征基线转录组特征，以确保识别出癌症患者中高特异性的RNA生物标志物。
作者将提取的全部cfRNA制备了全转录组RNA-seq文库。测序结果显示，血浆cfRNA以核糖体RNA（rRNA）和线粒体rRNA（Mt rRNA）为主，约占测序转录本的95%；mRNA在cfRNA中所占比例相对较小，与多数细胞类型中rRNA与mRNA的相对比例一致(图1a )。此外，与cfDNA相比，cfRNA在表达基因的外显子区显示出更高的覆盖率(图1b )。 与预期的成熟mRNA一样，在未表达基因中的覆盖率降低(图1c )，反映了不同表达谱的细胞类型的贡献。
图1. cfRNA特征分析
- cfRNA生物标志物的鉴定
为确定血液循环中正常RNA的来源，作者对非癌症样本中的cfRNA进行检测。结果发现，多数循环转录组来源于血细胞，反映了不同细胞类型在循环中的高丰度和周期性。此外，肝脏和脾脏中cfRNA显著富集，这可能是因为两器官均参与血液过滤，并与循环系统直接连通。这表明，非癌症个体血浆中的cfRNA和cfDNA具有共同的病因学来源，均源于血细胞和血液过滤器官的正常释放（图2a）。
基于正常样本的基线，作者对来自癌症个体的cfRNA也进行分析。结果显示，肿瘤组织样本中的cfRNA在乳腺和肺组织中含量相对较高，且在癌症血浆样本cfRNA中也检测到肺癌和乳腺来源的转录本，但肿瘤组织中组织特异性转录本的相对比例高于血浆中的估量，这表明癌症血浆中血细胞衍生的转录本可分化出组织特异性RNA，即可在癌症血浆中检测到肿瘤来源的RNA（图2b-c）。
图2. 血浆和组织样本中RNA量的评估
暗通道生物标志物具有组织特异性和亚型特异性
基于健康血细胞的RNA背景来识别肿瘤特异性转录本，在57,820个被注释的基因中，39,564个 (68%) 基因的转录本在非癌症血浆中未检测到。作者将在循环血细胞中无背景表达的基因组区域称为“暗通道生物标记基因（Dark channel biomarker，DCB）”，均符合以下标准：(1) 在非癌症血浆中未检测到；(2)与非癌症组相比，在癌症组的基因表达上调；(3) 在研究队列中多个癌症样本中均能检测到。
DCB基因在组织特异性基因中高度富集， 且与所发现的癌症类型相匹配：分别在乳腺癌和肺癌患者的血浆中检测到乳腺特异性和肺特异性的DCBs，这表明cfRNA具有预测肿瘤组织来源的潜力（图3）。
图3. 不同样本来源cfRNA中的DCB表达
cfRNA中DCB不仅表现出肿瘤类型特异性，其中30 %的DCB基因也对特定的癌症亚型具有特异性。在乳腺癌队列中，三阴性乳腺癌 (TNBC) 患者的cfRNA中FABP7上调，而激素受体阳性 (HR+) 乳腺癌中FABP7下调；SCGB2A2则相反，其在TNBC中下调，在HR+乳腺癌样本中上调(图4a )。该结果在另一队列中也得到验证(图4b )。这表明，DCB基因在血浆中的亚型特异性反映了其在肿瘤组织中的特异性表达。来自癌症基因组图谱( TCGA )的乳腺癌肿瘤样本中DCB表达分析也证实了这些标志物在更大的肿瘤组织样本中的亚型特异性表达(图4c )。DCB亚型特异性也延伸到肺癌中：6个肺DCB基因中的4个( CXCL17、SFTA3、SFTPA2和SLC34A2)在肺腺癌患者血浆中较鳞癌患者上调(图4d )；在匹配的肺癌组织样本和来自TCGA肿瘤组织样本中也观察到了同样的表达模式 (图4e-f)，表明了血浆和肿瘤组织中肺DCB水平的一致性。以上这些结果进一步证实了DCB基因的亚型特异性，即DCB基因具有组织特异性和亚型特异性，可预测肿瘤组织来源。
图4. cfRNA中DCB表现出肿瘤类型和亚型特异性
DCB基因的可检测性与血浆中肿瘤分数和肿瘤组织中的表达相关
为确定cf RNA中DCB基因的可检测性，作者使用靶向DNA测序计算所有匹配组织患者的肿瘤分数估计值,用乳腺生物标志物FABP7和SCGB2A2分析。结果显示，高肿瘤分数( > 1 % )但配对组织中无FABP7表达的患者血浆(BrCa31、BrCa44、BrCa3和BrCa19，图5a)中未检测到FABP7；低肿瘤分数但高肿瘤组织表达SCGB2A2的患者血浆(BrCa9、BrCa27和BrCa40，图5b)中检测到SCGB2A2；一些样本SCGB2A2和FABP7的肿瘤含量相对较高( > 1 % )，但在cf RNA中没有检测到这些基因。这表明肿瘤组织表达以外的其他因素可能会影响特定生物标志物在循环中的可检测性。
图5肿瘤分数和肿瘤含量对游离RNA中暗通道生物标志物基因可检测性的影响
- cfRNA生物标志物在单独队列中的验证
为验证上述23个cfRNA生物标志物的准确性，作者用血浆样本（乳腺癌 (n = 38) 和肺癌 (n = 18)）进行分析。结果显示，癌症组cf RNA生物标志物表达水平总体上随分期升高而升高，Ⅳ期样本(图6a)表达量最高。21个DCB基因的cfRNA可在>1个癌症样本中检测到，其中15个在至少1个癌症组中存在差异表达，具有癌症诊断潜力；7个在乳腺癌中差异表达(图6b )，14个在肺癌中差异表达，错误发现率≤ 1% (图6c )。总之，这些结果证实了23个DCB基因中的15个在癌症个体中的诊断潜力，并验证了DCB发现方法。
图6 .cfRNA中DCB基因的独立验证
总结：
1.在癌症和非癌症患者中对cfRNA进行了转录组评估，阐明了血浆中cfRNA的起源，并强调了特定于乳腺癌和肺癌的cfRNA。
2.研究结果对cfRNA在癌症检测和监测中的潜在应用具有重要意义，并为在其他癌症中识别高度特异性的cfRNA生物标志物提供了框架。
3.研究团队表示希望cfRNA能够用于多种癌症的早期发现，从而降低癌症死亡率。
Larson, M.H., Pan, W., Kim, H.J. et al. A comprehensive characterization of the cell-free tranome reveals tissue- and subtype-specific biomarkers for cancer detection. Nat Commun 12, 2357 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22444-1
