NAT CHEM BIOL丨用于细胞控制的可编程合成生物分子凝集物
大家好，今天分享的文献是2023年2月发表在Nat Chem Biol上的“ Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control ”。
有关作者：
本文作者是杜克大学生物医药工程系的Ashutosh Chilkoti教授，课题组的主要研究方向为：(1) 生物界面科学及其临床诊断应用。 (2) 基因编码的生物材料应用。
本篇文章主要涉及的是基因编码材料中的内在无序蛋白(IDPs)，该课题组2020年发表于 Nature Chemistry上的“De novo engineering of intracellular condensates using artificial disordered proteins”提出了从头设计IDPs的理念，并尝试将其用于细胞活动控制，也是本文的工作基础。
研究背景：
- 生物大分子凝聚物组织细胞的生物化学过程
液液相分离（LLPS）形成的凝聚物是研究活细胞中无膜细胞器的重要模型。LLPS的发生高度依赖溶液中生物大分子（如蛋白，DNA及RNA等）的浓度、物理化学性质，及溶液环境。形成相分离后，生物大分子以两种形式存在：一即在溶液中的低浓度状态和“液滴”中的较高浓度状态。这些“液滴”也被称为凝聚物，在生物过程中发挥着不同的作用，如提高催化效率、隔离大分子、感受应力等等。
- 内在无序蛋白（intrinsically disordered proteins, IDPs）
内在无序蛋白(IDPs)在细胞环境中极易诱导相分离的产生，往往与RNA加工、翻译等过程相关。Chilkoti课题组根据天然的弹性多肽为依据设计了具有20-80个重复的八肽序列(G 1 -R 2 -G 3 -D 4 -S 5 -P 6 -Y 7 -S 8 )XX ，与天然IDPs具有相似的热响应性，并且可以通过合理突变进行细致的性质调节，产生饱和浓度从nM到mM级别的凝聚物，从而实现不同的细胞生理过程控制。
整体设计：
在本篇文章中，作者主要通过对可以形成相分离的synIDP进行模块化设计，与不同的功能肽段融合，调节凝集物的物理性质，从而在细菌或哺乳动物细胞中通过相分离实现质粒隔离、转录调节、蛋白活性调节等控制。同时，作者对不同设计的synIDP形成的凝聚物的物理性质进行了验证，并建立计算模型来评估这些因素如何影响细胞过程。
结果与讨论：
1.在大肠杆菌中验证模块化构建的凝集物形成：
图1. 在活细胞（E.coli）和体外通过相分离形成合成凝聚物
作者选用了一类弹性蛋白样多肽（resilin-like polypeptides , RLPs）驱动相分离现象的形成，在该多肽重复序列的C段融合了可以用于结合DNA片段parS的多肽片段（DNA-binding domain，DBD），用于募集含有parS片段的质粒，同时还构建了含有C端二聚化结构域（C-terminal dimerization domain，DD）用于调节RLP的价态。作者首先在体外和E.coli分别研究了C端融合功能结构的RLP是否可以发生相分离。诱导表达后，通过共聚焦显微镜观测到随着时间增加，E.coli体内的凝聚物面积逐渐增加(图1a, b)。体外实验证明，凝聚物的形成是多肽浓度依赖的(图1c)，且DD的融合明显提高了液滴中的浓度Cdense (图1e)。
2. 合成的含有DNA凝聚物的性质
图2. 评估合成的含DNA凝聚物的分子动力学和渗透性
接下来，作者对含parS DNA元件的synIDP-DBD凝聚物性质、动力学及渗透能力进行了评估。体外实验证明，Cy3标记的parS序列被包裹在synIDP-DBD形成的凝聚物内(图2a, b)，增加靶DNA上parS位点的数量导致形成更大的RLP缩合物(图2c)。
在parS的存在的情况下，RLPwt-DBD-DD比RLP S-Y-DBD-DD的荧光恢复速度更快，且都可以隔离40kd Dextran(图2d, e)。进一步研究表明，去除DD可以调节凝聚物中蛋白质的动力学，而通过对RLP进行不同突变可以控制凝聚物中DNA的移动(图2f, g)。在E.coli中对形成的凝聚物进行荧光漂白恢复实验，观测到凝聚物性质与体外实验结果一致。
3. 凝聚物介导 DNA 隔离以控制基因流动
图3. 凝聚物介导 DNA 隔离以控制基因流动
作者首先构建了单个大肠杆菌中低渗透能力的冷凝物体系，用于隔离目标质粒，阻止质粒进入复制状态，导致质粒丢失。该体系由两个质粒构成，一个编码RLP WT -DBD-DD，由IPTG诱导表达，带有Kana抗性；另一个含有parS序列，有氯霉素抗性。被IPTG诱导RLP WT -DBD-DD表达后，靶标质粒的丢失使其失去氯霉素抗性，在平板的细胞数量减少了92%(图3c)。为了可视化目标质粒丢失，作者将编码RLP WT -DBD-DD与mEGFP融合，将CFP引入目标质粒中。在未诱导RLP WT -DBD-DD时，CFP存在于所有细胞中，而在诱导表达后，观察到细胞内凝集物的形成以及大多数细胞中CFP的信号丢失(图3d)，证明凝集物隔离了转录工具，导致目标质粒丢失。
为使用凝集物的形成促进质粒丢失以抑制大肠杆菌的水平基因转移，作者构建了一个接合系统，由一个缺乏功能性转移起点( oriT )的FHR质粒和一个携带oriT和parS位点的可移动质粒组成，并通过Ara诱导RLP WT -DBD-DD的表达，其中有parS序列的质粒转移降低了10倍以上(图3f)。
4. 凝聚物用于增强转录
图4. 凝聚物介导转录放大
作者构建了一个动力学模型来评估不同成分对转录扩增的影响，解释了凝结物形成后质粒的空间组织和转录机制。模拟结果表明，招募目标基因的凝聚物主要可以增强转录，因此，作者选择了本身无法结合DNA的突变转录激活因子SoxS(R93A)作为功能域来招募转录机器。通过构建 synIDP-SoxS(R93A)和 synIDP-DBD作为共激活因子来募集包含parS序列的目标质粒，目标质粒上的启动子仅仅驱动RFP的有限表达。
实验结果证明，当共激活因子均存在时，RFP信号最强(图4b)，并且观察到synIDP的明显共定位(图4c, d)。当目标质粒上parS的位点增加到两个，RFP的信号也增加到2倍(图4e)。
5. 凝聚物介导的哺乳动物细胞蛋白质活性调节
图5. 凝聚物介导的哺乳动物细胞蛋白质活性调节
接下来，作者通过设计凝聚物的相互作用来调节蛋白回路，并将其运用于哺乳动物细胞进行验证。在该系统中，报告蛋白Citrine与Degron融合，Degron可以通过蛋白酶体降解与其融合的蛋白，在报告蛋白的N端融合Czipper用于实现与Nzipper的相互作用。通过哺乳动物密码子优化的 RLP S-Y作为 synIDP 结构域，以驱动合成凝聚物的形成。当凝聚物形成时，报告蛋白被招募到其中，使得Drgron无法与配体结合，免于降解(图5b)。
作者在质粒共转染48h后对细胞内的黄色荧光进行了量化，其中，甲氧苄啶通过稳定degron来抑制报告蛋白的降解处理，甲氧苄啶处理仅含有Czipper-citrine-degron质粒的细胞作为阳性对照，仅包含Czipper-citrine-degron质粒的细胞作为阴性对照，代表报告蛋白的降解最大化。只有表达RLP S-Y-Nzipper和报告蛋白的细胞才能使荧光信号部分恢复约 25%(图5c)，同时在超分辨显微镜中观测到了凝聚物和报告蛋白的共定位(图5d)，证实报告蛋白信号的恢复是由形成的凝聚物介导的。
总结：
1.作者证明，具有可调序列组成的 synIDPs 允许对相行为和凝聚物的物理性质进行合理设计，赋予合成的凝聚物可编程功能，用于活细胞中的特定应用。
2.凝聚物的形成可以增加感兴趣分子的局部浓度，提供一个相对密闭的环境，可用于隔离目标质粒或将感兴趣的质粒和关键转录组件募集在冷凝物中以放大转录。
3.同时，该设计系统仍具有一定的缺陷，例如细胞功能调控需要严重依赖复杂的多肽序列和组件设计，并且多肽组件与招募的功能组件可能使得预期凝聚物的物理性质发生改变，并且在哺乳动物细胞中的运用仍然需要进一步的优化和探索。
文献信息：
Dai, Y., Farag, M., Lee, D. et al. Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. Nat Chem Biol (2023).
https://doi.org/10.1038/s41589-022-01252-8
