ACS Appl. Mater. Interfaces丨细胞膜锚定DNA逻辑门控纳米组件，用于细胞原位成像

大家好今天分享的文献标题为《Cell-Membrane-Anchored DNA Logic-Gated Nanoassemblies for In Situ Extracellular Bioimaging》。通讯作者为彭湃，安徽医科大学生命科学学院，主要研究方向为框架核酸和DNA纳米技术的逻辑门。

研究背景：

肿瘤微环境（TME）有以下特点：

1、氧气供给不足，肿瘤细胞只能够通过无氧酵解的方式进行能量代谢，这会造成乳酸的积累；与此同时，肿瘤细胞膜上的离子交换蛋白也在源源不断的将细胞内部H+运输到细胞外，避免造成自身酸中毒。这些细胞反应也在不同程度上造成肿瘤微环境PH降低，整体呈现酸性环境。

2、快速分裂的肿瘤细胞产生大量的K离子进入细胞外微环境，使Akt-mTOR磷酸化途径失活并阻断T细胞效应功能，从而使T细胞功能急剧减弱，导致癌细胞逃避免疫系统和不受控制的增殖。

3、同时，恶性肿瘤TME中三磷酸腺苷（ATP）显著高于健康组织环境，TME中的ATP水平比健康组织高1,000~ 10,000倍，这导致抗肿瘤免疫抑制，增加癌细胞生长和转移扩散的风险。

本文主要利用了TME中的K离子与ATP含量高于正常组织的特点进行设计，开发了可用于肿瘤细胞原位成像的DNA纳米传感器。

结果与讨论

1、细胞表面锚定TFNAs的表征

作者设计了两种含三个胆固醇基团的TFNA单体。Cy3和Cy5荧光团修饰的双分子G4s分别被拴在TFNA-a和TFNA-b的顶点上，以响应细胞外K+。利用PAGE和AFM对其结构完整性和形貌进行了表征。作者首先将TFNA单体与HeLa细胞孵育一段时间，并使用激光共聚焦显微镜分析其锚定效率。与实验组对比，没有修改胆固醇的对照组中没有观察到荧光信号。在三维(3D)激光共聚焦图像中，可以清楚地看到大部分荧光信号在细胞边缘附近，这表明TFNA探针可以牢固地锚定在细胞表面。

细胞外K+浓度对 TFNAs的影响

作者首先在体外评估了纳米传感器的性能。在K+存在下，TFNA单体二聚形成稳定的双分子结构，由折叠的双分子G4连接。随着K+浓度的增加，TFNA单体的凝胶带逐渐消失。这种二聚化过程伴随着荧光基团的空间接近，从而诱导了从Cy3到Cy5的FRET。当K+浓度从0增加到180 mM时，作者观察到FRET信号的增加。相对荧光高度依赖于K+浓度，在10到180 mM范围内与K+浓度呈良好的线性关系，同时共聚焦成像也呈现相同的结论，对TME的其他常见金属离子具有良好的选择性。此外，作者还利用高功率640 nm激光照射Cy5进行了光漂白实验，以充分肯定K+诱导的FRET信号。

电路控制部件3WJ-A与3WJ-B的设计和体外表征

由于抑制癌细胞增殖与ATP敏感性钾通道密切相关，作者设计了两个3WJ单体用于细胞外K+和ATP的生物计算传感，并将它们连接到胆固醇标记的TFNAs上。用凝胶电泳法证实了TFNA-3WJ的逐步组装。在TFNA-3WJ A的一条延伸臂上部分阻断了ATP适配子。当加入ATP时，ATP适体被诱导折叠成ATP-ATP适体复合体，并从TFNA-3WJ-A释放。此外，双分子G4的两部分被拴在TFNA-3WJA和TFNA-3WJ-B的左臂上，然后在K+诱导下TFNA-3WJ之间发生异源二聚。在K+和ATP存在下，3WJ-A暴露的互补区与3WJ-B的互补区结合，形成紧密环化的分子结构。在这个过程中，异质二聚化可以看作是一个以K+为输入1的YES逻辑门，其输出作为后续AND逻辑门的两个输入之一，这与YES-AND逻辑电路的特点是一致的。最后，邻近DNA杂交诱导的FRET是最终的输出。凝胶电泳法首次用于表征3WJ生物计算纳米传感器对外界刺激的响应性能。使用一系列阴性对照作为参考。在没有K+的情况下，所有3WJ都保持单体状态。在ATP存在下，部分被阻断的适配子折叠成ATP-适配子复合体并远离3WJ-A，这导致了一个相对较小的结构比没有ATP形成的。在这种情况下，3WJ末端的几个互补碱基不能诱导3WJ的异二聚化。在K+加成后，观察到能带迁移率的移动，表明3WJ混合物二聚成异二聚体结构，对应于逻辑电路的YES选通部分。在ATP和K+的存在下，3WJ在二聚过程中发生了环化反应，形成了稳定的分子内结构，与对照带相比，谱带发生了明显的移动。这两个因素促成了邻近DNA杂交，这与YES和布尔逻辑电路特征一致。接下来，作者将上述3WJ单体分别拴在TFNAs的顶端，在电泳和荧光实验中也可以清楚地观察到类似的逻辑行为。这些结果为后续的细胞表面逻辑生物成像提供了可能。观察到标记的Alexa555和Alexa 647。在K+和ATP的加入后，作者观察到A.F.555荧光的减少和FRET诱导的A.F.647信号的增加，这与电泳结果相一致。此外，对照组的荧光信号在这些条件下保持不变，排除了外部刺激的非特异性影响。当三磷酸腺苷浓度增加到500μM并且与三磷酸腺苷浓度在5到200μM之间具有良好的线性关系时，可以实现最佳性能。与正常组织中较低的三磷酸腺苷水平相比，YES-AND电路仅在TME中较高的细胞外三磷酸腺苷浓度时才显示可检测到的FRET信号，此外该工作系统对ATP的选择性高于其他类似物，包括GTP、UTP和CTP。综上所述，这些数据证实了所提出的智能纳米传感器对细胞外K+和ATP的是和逻辑行为以及传感性能。

用于原位细胞外生物成像的活癌细胞膜的智能生物计算

接下来，作者试图将设计的智能逻辑纳米传感器应用于活的癌细胞膜上。将标记有胆固醇的TFNA3WJ单体与HeLa细胞在室温下孵育，可以将生物计算传感器固定在细胞膜上。此后，使用荧光共聚焦显微镜检测响应细胞外刺激的荧光信号输出。K+或ATP单独处理细胞表面只略微增强了FRET信号，而联合处理有助于显著的荧光增强。此外，作者评估了对照 组在相同条件下的表现，并在所有情况下检测到非常微弱的FRET信号。作者进行了荧光强度的定量分析，以进一步阐明FRET的变化，与体外实验结果一致。这些发现清楚地表明，所提出的智能布尔逻辑纳米组装可以响应细胞外微环境的变化而执行识别然后计算的操作，并以FRET信号作为最终反馈。

总结：

作者成功地开发了一种新型的细胞表面锚定智能纳米传感器，用于活细胞表面的细胞外刺激的原位成像。细胞外K+和ATP是两个输入信号，FRET信号是输出信号。

该传感器对细胞外微环境变化进行YES-AND逻辑运算，具有优异的灵敏度和选择性。由于TME中的K+和ATP水平明显高于正常组织，因此所提出的逻辑电路控制的纳米组装原则上可以精确定位癌细胞，并为调节细胞功能(例如细胞代谢和电活动)的ATP敏感K+通道的机制研究提供了新的方法。用其他与小分子、蛋白质或疾病相关靶标结合的适体取代3WJ-A中的ABA27，原则上可以构建各种新型的逻辑生物传感平台，这可能有助于智能抗癌药物的靶向输送和布尔逻辑控制癌症治疗的发展。