SCIENCE丨哺乳动物细胞间通讯和接触史的监测

大家好，今天给大家分享的文献来自中科院生化所的周斌课题组，题目是《哺乳动物细胞间通讯和接触史的监测》。

细胞间的相互作用广泛存在于多细胞生物中，并对许多细胞生物学功能起到至关重要的作用，这些作用包括胚胎发育、免疫反应、干细胞分化、肿瘤产生等。既往监控细胞间相互作用的方法主要是通过邻近反应标记相互作用的细胞，或者产生肿瘤细胞分泌的细胞穿透荧光蛋白的用于标记肿瘤转移灶中的细胞。但是，既往的研究都无法做到长期监测细胞间的相互作用，比如无法检测成熟 T 细胞迁移至淋巴器官前的 T 细胞祖细胞和胸腺细胞等等，也无法检测肿瘤细胞在其生长处与周围细胞间的瞬时作用。为了理解活体内细胞间的动态相互作用，作者利用了Syn-notch技术，构建了sender cell和receiver cell来追踪活体内细胞间的相互作用。另外，作者还结合了CRE 重组酶技术用于辨认和操纵由细胞间相互作用影响到的细胞间相互作用。

图1 体内细胞-细胞接触的遗传标记

设计原理（图1）：Notch信号通路介导相邻细胞间的相互作用，经典的Notch信号通路包括带有配体的细胞、Notch胞外段受体、Notch跨膜区的r-分泌酶、以及Notch胞內段具有转录活性的蛋白。当Notch胞外段受体与另一个细胞上的配体结合后，r-分泌酶活性被激活，从而切下Notch胞內的转录因子，转录因子进入细胞核激活下游基因表达。作者利用Notch信号通路可模块化组装的特性，将Notch的胞外段换成靶向GFP的单抗（a-GFP），胞內段换成靶向激活tetO启动子的转录因子，当表达这样的Syn-Notch的Receiver cells遇到表达GFP的sender细胞时，Sender cells的GFP会激活Receiver cells的Synotch、释放tetO启动子的转录因子，从而激活下游tetO控制的基因LacZ的表达，LacZ的表达能催化底物X-Gal，这样就能通过底物的显色反应检测到细胞间的相互作用了。作者首先拿心肌细胞作为Sender cells，拿内皮细胞作为Receiver cells，构建了心肌细胞特异性表达膜定位GFP，内皮细胞特异性表达上述syn-Notch的小鼠，这样就可以通过X-Gal染色观测内皮细胞是否和心肌细胞有相互作用。作者在胚胎发育第9.5天分别单独验证心肌细胞是否能表达GFP、单独验证syn-notch是否能被内皮细胞表达、验证心肌细胞和内皮细胞是否能各自表达GFP和Syn-Notch。最后通过X-gal底物检测Sender cells和Receiver cells同时存在的情况下，内皮细胞是否能催化X-Gal底物显色，结果如作者所料，这个方法确实能检测到X-gal的显色，证实心肌细胞与内皮细胞在小鼠胚胎发育期由相互作用。为明确X-gal的催化是Syn-Notch信号激活造成的，而不是LacZ的信号泄露，作者使用Dox抑制剂、DAPT抑制剂分别从tetO启动子、r-分泌酶抑制他们的活性，这只相互作用就消失了，证实作者构建的这个Syn-Notch，他本人命名为GLCCC的系统能够用于检测细胞间的相互作用。

图2 与心肌细胞接触过的内皮细胞的遗传追踪

为了能够跟踪与Sender cells有任何接触史的Receiver cells，作者在 synNotch 通路的下游整合了 Cre-loxP 系统（图2）。 tTA 报告基因被 tetO-Cre 和 Rosa26 (R26)-floxed-Stop-reporter 取代，后者位于普遍活跃的基因位点 Rosa26。当Sender cells和Receiver cells接触，就会触发 synNotch 通路的激活和 tTA 易位到细胞核中，从而开启了Receiver cells中 Cre 重组酶的表达。然后 Cre 介导不可逆的 Cre-loxP 重组，使得 tdT 在Receiver cells及其所有后代中表达，从而永久标记它们，此处的tdT是红色荧光蛋白。因此，任何接触事件都会对Receiver cells的后代细胞进行基因标记（可通过红色荧光检测到），作者命名带有synNotch和Cre-loxP的小鼠为gTCCC小鼠。

作者研究了发育中的小鼠心脏中心内膜 内皮细胞的的迁移和分化。心脏 内皮细胞在早期胚胎心脏发育过程中与心肌细胞接触。在心脏瓣膜形成过程中，这些心内膜 内皮细胞转变为间充质，并通过内皮-间质转化 (EMT) 程序迁移到心脏垫中。在小鼠中，心内膜 EC 与 CM 的分离在 P0期 之前就已完成，此时心脏垫已重塑为心脏瓣膜，瓣膜中的间充质细胞不再表达任何 内皮细胞的标记物（图 2）。作者生成了Tnnt2-mGFP；Cdh5-aGFP-N-tTA；tetO-Cre；R26-tdT 的 heart-gTCCC 小鼠（图 2）。在 E9.0 时在 heart-gTCCC 小鼠中观察到的 tdT 信号表明心脏内皮细胞已成功记录了接触事件，并且它们的间充质后代在 E10.0 时保持 tdT 表达。这些数据表明，遗传示踪剂 tdT 永久保留在受体细胞及其所有后代中，即使它们的后代改变了细胞命运，例如，由于心脏瓣膜发育过程中的 EMT。另外，在 P0 时，即使在瓣膜中变成间充质细胞的内皮细胞后代与 心肌细胞相去甚远，但它们仍保持 tdT 表达，这证实了它们的 EMT转变。因此，上述结果证实即使在Receiver cells发生分化、转变为间充质细胞后，细胞间曾经的相互作用依然被记录了下来。

图3 肿瘤生长过程中肿瘤细胞-内皮细胞相互作用的遗传追踪

为了进一步证明 gTCCC 在追踪细胞接触史方面的效用，作者研究了肿瘤血管生成中的血管 内皮细胞，在此期间血管从外周组织募集到缺氧肿瘤中。在这种病理条件下，内皮细胞会迁移到肿瘤中，他们与肿瘤细胞的接触促进肿瘤增值。作者构建了mGFP的小鼠肺肿瘤细胞系（TC）作为Sender cells细胞，并且这些细胞与来自宿主小鼠的浸润性内皮细胞直接接触。为了从基因上追踪肿瘤浸润性 内皮细胞，作者将 TC-1-mGFP 肿瘤细胞植入 Cdh5-aGFP-N-tTA；tetO-Cre； R26-tdT 受体小鼠，并在植入后 7 天和 14 天收集组织用于检测。第 7 天时，内皮细胞在 TC-1-mGFP 肿瘤中显示出红色荧光（图 3）。

图4 带有Cre诱导的R26-mGFP的Sender cells的小鼠系

为了将 gLCCC 和 gTCCC 系统的应用扩展到仅与特定Sender cells接触的受体细胞，作者生成了敲入小鼠系 R26-mGFP，用于 mGFP 配体在Sender cells中的 Cre 依赖性表达。作者将 mGFP 基因插入到广泛存在的 Rosa26 基因座中，mGFP 编码序列位于 loxP 侧翼的 3x polyA 终止盒之后，使 mGFP 表达可在 Cre 重组酶给药后诱导。 E15.5 R26-mGFP 胚胎的整体荧光或切片染色显示没有 GFP 表达（图 4），表明没有 Cre 重组酶的 GFP 表达没有泄漏。相比之下，ACTB-Cre；R26-mGFP 胚胎在所有细胞中都有 Cre-loxP 介导的剔除，在整个过程中产生 GFP 表达，表明靶向细胞中的 mGFP synNotch 配体表达是 Cre 依赖性的（图4）。

为了将 R26-mGFP 小鼠研究任何其他 Cre+的细胞和内皮细胞接触，作者将它们与 Nestin-CreER 杂交，Nestin-CreER 是 Nestin+ 细胞中的一种诱导型 Cre 驱动因子，包括神经元、附睾血管平滑肌细胞和成肌细胞。作者生成了 Nestin-CreER；R26-mGFP 发送器和 Cdh5-aGFP-N-tTA；tetO-tdT 接收器或 Nestin-gLCCC 小鼠。作者在 E12.5 用他莫昔芬处理 Nestin-gLCCC 小鼠以诱导 Cre 激活，并发现在 E15.5 一些 GFP+ 细胞表达神经元核蛋白 (NeuN)。 E15.5 胚胎矢状切面的荧光成像显示 tdT 信号反映了 GFP 表达模式 。作者发现，与Nestin+细胞接触的内皮细胞位于三叉神经节、背根神经节和肋间神经血管束中，但在大脑中未检测到 tdT+ 内皮心（图 4）。作者证实 EC 中的 tdT 表达受 tet 调节的遗传系统控制，因为 Dox 给药抑制了 Tam 处理的 Nesting-gLCCC 小鼠内皮细胞中的 tdT 表达（图 4）。因此，R26-mGFP 适用于从任何表达 Cre 的细胞类型生成Sender cell（图 4）。

图5 在Receiver cell中生成用于Cre诱导的aGFP-N-tTA的H11-aGFP-N-tTA小鼠系

为了找到与特定发送细胞相互作用的所有细胞类型，作者构建了一个敲入小鼠系H11-aGFP-N-tTA，用于Receiver cell中aGFP-N-tTA受体的Cre依赖性表达（图5）。然后，作者将aGFP-N-tTA表达盒插入另一个普遍存在的基因位点Hipp11中，aGFP-N-tTA编码序列跟随loxP侧翼的3x polyA终止盒，以使受体表达在Cre重组酶给药时可诱导。E15.5 H11-aGFP-N-tTA胚胎的切片染色显示没有Myc-aGFP表达（图5B），表明没有Cre重组酶的受体表达。相比之下，Tie2-Cre;H11-aGFP-N-tTA胚胎在所有内皮谱系中均有Cre-loxP介导的切除，在整个过程中产生受体表达（图5），证明靶细胞中的aGFP-N-tTAsynNotch受体表达是Cre依赖性的。

为了在研究细胞间相互作用时对 H11-aGFP-N-tTA 小鼠进行功能表征，作者将 Tnnt2-mGFP 小鼠与 Tie2-Cre 杂交；H11-aGFP-N-tTA 小鼠并使用 tetO-tdT 作为它们接触的读数（图.5E）。在 Tnnt2-mGFP；H11-aGFP-N-tTA；tetO-tdT 小鼠中，作者无法检测到心脏中的 tdT 表达，除非小鼠与 Tie2-Cre 小鼠系杂交（图 5）。对 Tnnt2-mGFP；Tie2-Cre；H11-aGFP-N-tTA；tetO-tdT 小鼠的 GFP 和 tdT 心脏切片进行免疫染色，显示血管模式中的 tdT 表达（图 5）。心房和心室中的大多数内皮细胞是 tdT+。在其他器官或组织中未检测到 tdT+ EC（图 5），表明受体表达细胞的遗传活性也依赖于来自Sender cells的配体，例如 mGFP+ CM。因此，H11-aGFP-N-tTA 适用于从任何表达 Cre 的细胞类型生成受体细胞（图 5）。

总体而言，作者设计的 gLCCC 系统的动态监测能力揭示了内皮细胞与其他细胞谱系在发育、组织稳态和病理条件下的动态相互作用。gTCCC系统的追踪能力检测了心内膜细胞对肝血管系统和肿瘤血管生长的作用。除了揭示细胞间接触之外，作者展示的接触依赖性细胞追踪还提供了一种潜在的体内细胞分化追踪的新方法，可用于研究细胞从其起源迁移和/或采用新命运的细胞的位置信息在发育、稳态、再生和疾病期间。