ACS CENTRAL SCI丨使用聚糖束缚肽连接酶直接鉴定活细胞上的蛋白水解裂解

大家好，今天给大家分享一篇近期发表在ACS Central Science上的题目为《Direct Identification of Proteolytic Cleavages on Living Cells Using a Glycan-Tethered Peptide Ligase》的文章，通讯作者是来自美国加州大学旧金山分校的James A. Wells教授，其主要研究方向包括蛋白质和细胞工程研究，化学生物和化学药理研究等。

细胞表面蛋白质组由大约3000个蛋白质组成，这些蛋白质使细胞能够感知环境、接收细胞外信号、与邻近细胞相互作用并控制细胞进入。细胞内蛋白质的功能多样性由数百种不同的翻译后修饰控制，蛋白水解修饰是一种常见的和必需的细胞表面翻译后修饰，由大量膜结合和分泌的蛋白酶在细胞外催化。

本文中，作者报告了一种新的蛋白质组学方法（即细胞表面N-末端组学），其能够广泛识别活细胞表面的精确裂解位点(neo-N-末端)。用N端亲核试剂对工程肽连接酶(称为稳定酶)进行了功能化，使其能够与天然的聚糖共价连接。在添加生物素化肽酯后，糖链稳定酶能有效地标记细胞外neo-N-末端，用于蛋白质组学分析（图1B）。为了证明这种方法的通用性，作者在包括原代免疫细胞在内的不同细胞类型中鉴定和表征了1532个细胞外neo-N-末端，绝大多数的裂解位点没有被以前的蛋白质组学发现。细胞表面N-端组学是一个可推广的平台，可以揭示蛋白水解的新表位。

图1 用于鉴定活细胞表面蛋白水解修饰的细胞表面N-末端组学

结果与讨论：

1.将稳定酶粘附到天然聚糖上使细胞表面neo-N-末端的高效标记成为可能

末端组学是基于枯草杆菌酶的蛋白质组学技术，枯草杆菌酶是一种机械工程设计的连接酶，可以在复杂环境中特异性标记蛋白质末端的α-胺。虽然枯草杆菌酶能有效地捕获细胞内的蛋白水解底物，但当标记完整的细胞或细胞裂解物时，很少能识别细胞表面的neo-末端。此前，作者在HEK293T细胞中遗传编码了一种跨膜枯草杆菌酶，该酶定位在细胞表面并能有效标记膜蛋白。这种方法能鉴定数百个细胞外neo-末端，但它需要细胞工程来达成，因而应用受限。

在本文中，作者开发了一种可通用的细胞表面N-末端组学方法，可以在不需要遗传操作的情况下确定各种细胞类型的蛋白水解位点。作者使用亚胺连接策略（图2A/B）：含有二醇的聚糖对轻度高碘酸盐氧化敏感，并形成可与氨基氧基或肼基亲核试剂偶联的醛。用高碘酸钠处理HEK293T细胞，使其在聚糖上形成醛，然后将它们与稳定酶和胺催化剂孵育，通过流式细胞术和免疫荧光染色确定了两种α-亲核稳定酶能够在细胞上附着到细胞上（图2C/D）。为了评估附着特异性，作者在附着之前用霍乱弧菌唾液酸酶(一种修剪末端糖的水解酶)对细胞进行预处理，观察到细胞上亲核修饰的稳定酶水平降低(图2E)，说明α-亲核修饰的稳定酶通过氧化聚糖结合在细胞上。

图2. 稳定酶上的N末端亲核修饰介导与细胞表面聚糖的共价结合

之后，在生物素化肽酯作用下（图3A），通过流式细胞术、免疫荧光和蛋白免疫印记评估了HEK293T上显示的糖系(GT)稳定酶的连接酶活性（图3B/C/D），结果表明GT-稳定酶能够广泛标记细胞表面蛋白，α-亲核稳定酶是细胞表面N-末端连接的较好偶联物。

图3. GT稳定酶能有效标记细胞表面蛋白

2. 细胞表面N-末端组学能够捕获不同细胞类型的neo-N-末端

作者将上述策略用于检测HEK293T细胞表面蛋白N末端，鉴定了507条abu标记的肽(neo-N-末端)，这些肽映射到定位于质膜的膜蛋白、细胞外分泌蛋白或gpi锚定蛋白的细胞外蛋白(图4A)。大多数蛋白是1型单通道蛋白(53%)，包括多通道蛋白(20%)、分泌蛋白(15%)和gpi锚定蛋白(11%)。然后，作者对包括贴壁细胞和原代免疫细胞在内的一系列不同细胞类型进行了细胞表面N-端组学(图4B)。在测试的6种细胞类型中，观察到数百个N-末端，贴壁细胞系的范围为500-600，免疫细胞的范围为200-400。大多数细胞外neo-N-末端是由成熟后裂解产生的(平均74%)，而其余主要是信号序列裂解后产生。将细胞表面N-端组学与Topfind 4.1数据库进行了比较，发现只有143个N-末端(约9%)也在Topfind 4.1数据库中被发现，其中约50%来源于单通道蛋白或分泌蛋白的细胞外区域（图4C）。此外，作者还将数据与CSPA数据集合（利用细胞表面捕获蛋白质组学鉴定了1492种细胞表面蛋白）进行比较，观察到细胞表面N-端组学和CSPA之间的蛋白有显著重叠(67%)。这些比较进一步证明了GT-稳定酶在细胞表面产生广泛的N-末端覆盖，与其他方法相比具有不同的效用。

图4. 细胞表面N-末端组学广泛捕捉不同细胞类型的neo-N-末端

3.单个癌基因诱导细胞表面的蛋白水解性重塑。

细胞疾病状态通常与蛋白水解修饰失调相关，但识别和定量特定癌基因诱导的裂解仍然具有挑战性。作者使用细胞表面N-端组学量化了KRAS(G12V)和HER2两个癌基因对细胞膜蛋白水解重塑（图5A），最终定量了151个蛋白质的303个N -末端肽，并在89个具有差异丰度(1.8倍阈值)的蛋白质上观察到233个neo- N -末端。其中，35% - 40%的细胞外neo-N-末端在HER2过表达和KRAS(G12V)数据集中重叠，共享肽也以类似方式富集或减少(图5B)。如图5C所示，在这两种致癌转化中富集的细胞外neo- N-末端，主要映射到细胞黏附蛋白和跨膜信号受体。最后，作者绘制了细胞外neo- N-末端的变化倍数和表面表达的变化倍数，52个丰度变化大于1.8倍的neo-N-末端映射到31个蛋白质，蛋白质丰度比率与N末端丰度适度相关（图5D）。对CSC和N-末端组学在亲本和转化细胞系中检测到的蛋白质（Notch2、DSG2、LDLR和CAD13）进行了Western blot分析（图5E）。结果表明，细胞表面N-末端组学可以准确捕捉致癌转化后出现的蛋白水解修饰。

图5. 单一癌基因（HER2和KRAS G12V），驱动细胞表面共同和独特的蛋白水解裂解。

综上，作者提出了一种可推广的蛋白质组学策略来识别人类细胞类型的膜表面蛋白裂解，将亲核修饰的连接稳定酶共价到细胞膜表面氧化聚糖，有效地标记非糖基化和糖基化细胞表面蛋白的neo-N-末端，并在多种细胞类型(包括贴壁永生化细胞系和原代免疫细胞)中验证了这一策略，探索了常见癌基因诱导的蛋白水解改变。