韩 达 课 题 组

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NAT CHEM BIO丨一种可以改变代谢辅因子还原势能的RNA适配体

大家好,今天分享的文献为2022年11月发表在Nature Chemical Biology上的《An RNA aptamer that shifts the reduction potential of metabolic cofactors》,两位通讯作者分别是来自美国圣路易斯大学的Dana A. Baum教授和密苏里大学的Donald Burke-Agüero教授,两位教授的研究方向主要是探索RNA适配体和酶的特殊生理学功能,尤其是RNA的结合功能及催化活性。

背景

1981年度诺贝尔化学奖获得者吉尔伯特(W. Gilbert)提出了“RNA世界”的假说,指出 “在生命起源的某个时期,生命体仅由一种高分子化合物,即RNA组成。遗传信息的传递建立于RNA的复制,其复制机理与当今DNA复制机理相似,而作为生物催化剂的、由基因编码的蛋白质还不存在”。因此,核酶的发现使得科学家们对“RNA世界”中RNA作为原始催化剂的潜力进行了不断的探索。现代氧化还原酶会结合不同的氧化还原辅因子,通过改变其还原电位的大小来增加酶的催化能力,而现如今这种RNA的催化策略尚未得到充分研究。本文的研究工作展示了一种RNA适配体,它优先结合黄素单核苷酸(FMN),并显著将其还原电位变化了-40 mV。利用核磁共振实验揭示了该RNA适配体与FMN之间的π-π和供体原子-π相互作用,表明RNA结合口袋的局部环境会驱动辅因子的还原电位发生变化,该现象解释了在“RNA世界”中RNA作为原始催化剂可能在代谢反应中所发挥的作用。

氧化还原反应是生物体新陈代谢的基础。含腺苷一磷酸的辅助因子,如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),常被代谢途径中的关键酶结合来参与反应,因此它们被视为早期“RNA世界”中非常重要的参与者。氧化还原代谢的一个基本规则是:电子沿能量梯度移动,移动方向由电子供体和受体的中点还原电位(Em)决定。例如,游离黄素Em值约为-210 mV,因此它只能将自身电子转移到具有更正Em值的反应底物上,或者从具有更负Em值的反应底物中接收电子。蛋白质酶通过识别氧化和还原辅因子的能量差异来结合黄素,并显著改变其Em值(图1a),使它们能够跨越更宽范围的Em值来与底物反应。当黄素非共价结合在酶上时,具有的Em范围为0 mV至-360 mV;而共价结合的黄素Em可变为+160 mV。由于结合作用的出现,蛋白结合口袋内的局部化学环境发生了变化,导致黄素酶中出现大范围Em值变化,这使得黄素可以更广泛地参与到不同反应中。类似地,如果RNA也可以利用氧化和还原辅因子的差异来识别并改变Em值,这将为原始RNA在“RNA世界”中催化各种代谢反应提供一种潜在的机制,并为合成生物学领域内的多种氧化还原核酶的设计提供新起点。

结果与讨论

1.与氧化形式黄素特异结合的RNA适配体

研究人员首先通过体外筛选的方法得到了对FAD具有结合亲和力的RNA适配体,将序列截短至38nt,命名为X2B2(图1b)。RNA-黄素复合物的形成可通过紫外可见(UV-Vis)光谱监测:游离FAD最大吸收(λmax)在450 nm处,同时在377 nm处具有较小的第二个峰;在X2B2的存在下,λmax红移至456 nm处,两个肩部各在482 nm和430 nm处,第二个峰在384 nm处(图1c)。对X2B2茎和环中的核苷酸进行碱基突变,发现将L2环中C14替换为U14的突变体X2B2-C14U与FAD具有更好的结合力,Kd= 243 ± 28 nM(图1d-e)。同时,研究发现X2B2与核黄素(Rb)和FMN结合的峰具有相同特征(图2),这表明主要结合部位是黄素的共同基团区域:异丙氧嗪环(图3g)。

图1:RNA适配体X2B2结合导致黄素吸光度红移和新峰出现

 

图2:X2B2分别与Rb和FMN的结合表征

2.RNA适配体结合黄素后改变Em

为了确定RNA适配体与黄素的结合是否会改变其还原电位,作者使用黄嘌呤氧化酶偶联酶测定法测量了结合黄素后复合物的Em值,该测定法通过同时监测黄素和参考染料的氧化还原比来得出Em值(图3a-f)。因为FAD的Em改变是由RNA和黄素的相互作用驱动的,所以与FAD具有相同异丙氧嗪环结构区域的FMN和Rb的适配体复合物也被观察到了相似的结果,氧化还原测定的结果以及不同的黄素结构总结在图3g中。结果表明,X2B2-C14U与FMN的结合对Em具有最为显著的影响,△Em=-40mV。

图3:X2B2及X2B2-C14U结合黄素并改变中点还原电位

3.X2B2-C14U-FMN复合物的核磁共振分析

为了明确RNA适配体与黄素的相互作用模式,作者利用液体核磁共振对X2B2-C14U-FMN复合物进行结构表征(图4a,b)。二维NOESY核磁谱图显示A22和C23存在NOE,表明顶端环残基向后折叠并插入主凹槽(图5a)。结合口袋下方出现4层三元碱基平面,分别是U30:A10·A9、C29:G11·C23、A12:U28·A22和U14·G13·G27(图5b)。其中U30·A10·A9三元碱基平面位于黄素结合口袋下方最远的位置,作者对其进行突变以确定该三元碱基平面结合黄素的重要性。突变策略包括去除A9和改变U30:A10相对于结合口袋的位置,获得X2B2-ΔA9、X2B2-C14U-ΔA9、X2B2-BT1和X2B2-C14U-BT1四种突变体。结果显示,两种X2B2突变体几乎完全丧失与黄素结合的能力(图5c),表明U30·A10·A9三元碱基平面虽远离黄素结合位点,但可能通过锚定其他三元碱基平面的形成来稳定整体结构;而两种X2B2-C14U突变体对黄素结合能力下降但不至于完全丧失;移除A9对结合力的影响最大,说明A9在黄素结合中扮演了非常重要的角色(图5d)。

 

图4:X2B2-C14U–FMN复合物结构

图5:X2B2-C14U–FMN复合物结构中的三元碱基平面

在结合口袋中,FMN的H6和H7α(甲基氢)与适配体的U14和G15之间检测到NOE信号(图 6a),表明FMN的二甲苯环通过π-π堆叠夹在适配体的U14和G15之间,U14与FMN的si面相互作用,G15与FMN的re面相互作用(图 6b)。同时发现X2B2-FMN的NOE信号与X2B2-C14U-FMN的几乎相同,表明X2B2和X2B2-C14U具有相同的黄素结合模式(图6b,6c)。

图6:X2B2及X2B2-C14U-黄素结合口袋的π–π和供体原子–π相互作用

分子动力学模拟结果显示G13和U18的2′-OH与FMN的N5的距离在3.3 Å内,表明RNA和黄素之间可能会存在氢键。因此作者继续研究了X2B2-C14U中G13和U18碱基处脱氧取代的突变体与FMN结合的能力来验证氢键的存在与否。结果显示脱氧取代的突变体与FMN的结合作用仅有轻微下降(图6d),说明氢键并不是参与结合的主要作用力。FMN的C4a和N5是与溶剂接触的(图6f),异丙氧嗪环的溶剂可接触表面积为7.1 Å2(相比对于未结合的异丙氧嗪环为336.7Å2),这使得FMN能够与其他分子反应,例如黄嘌呤氧化酶测定中使用的甲基紫精介质,并可能与工程氧化还原核酶中的底物反应。

复合物结构显示14号位的C或U碱基靠近FMN,同时该碱基对结合亲和力和ΔEm都有较大影响,因此作者将该位置替换为嘌呤碱基或删除嘧啶碱基(X2B2-C14A、X2B2-C14G和X2B2-ΔC14)。突变体X2B2-ΔC14完全失去了黄素结合能力,而嘌呤突变体的黄素结合能力显著减弱(图6g),表明14号位的嘧啶碱基对结合黄素有至关重要的作用。

总结

RNA结合口袋的局部化学环境不仅是一个被动的相互作用面,而且能够显著改变其结合的氧化还原辅因子的中点还原电位(Em)。X2B2适配体及其X2B2-C14U突变体都出现了类似于黄素蛋白中观察到的相互作用,包括与异丙氧嗪环的π-π堆积和供体原子-π相互作用,以实现通过大幅改变Em值来与不同底物发生反应的目的。该研究提出了早期RNA可能利用的催化策略:通过改变辅因子的还原电位让它们在“RNA世界”中参与广泛的代谢反应。

2022年11月30日 21:12
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