NATURE丨E3泛素连接酶的抗体靶向用于受体降解

大家好，今天给大家分享一篇发表在Nature上的题为《Antibody targeting of E3 ubiquitin ligases for receptor degradation》的文章，通讯作者是美国基因泰克公司的Nicholas J. Agard和Felipe de Sousa e Melo。

目前大多数针对质膜受体的治疗方法都是通过拮抗配体结合或酶的活性来发挥作用。哺乳动物蛋白由多个结构域组成，这些结构域执行不连续但协调的活动。因此对一个结构域的抑制往往不能完全抑制一个蛋白质的功能。靶向蛋白降解技术，包括蛋白水解靶向嵌合体 (PROTACs)，已经突出了靶向降解相比于抑制的临床重要优势。但PROTACs渗透性、药代动力学和药效较差，因此科学家需开发新的更有效的方法来降解细胞膜受体蛋白。在这些发现的基础上，作者开始探索细胞固有的降解机制，用于基于抗体的靶向蛋白降解平台，将具有暴露的细胞外结构域(ECDs)的膜结合E3泛素连接酶作为有吸引力的候选蛋白。

结果与讨论：

wnt反应连接酶的鉴别

在细胞表面E3泛素连接酶中，作者重点研究了RNF43和ZNRF3，这是已知的Wnt信号的负调控因子，通过泛素化介导的降解促进Wnt受体卷曲/低密度脂蛋白受体相关蛋白(FZD/ lrp)的周转。为了模拟异常的Wnt信号，作者生成了小鼠肠道类器官，该类器官在大肠腺瘤性息肉病（Apc）基因中含有移码截断（图1a），导致Wnt通路过度激活和结肠癌的发生。与野生型类器官相比，对类器官(Apc−/−)的基因表达分析显示wnt的表达显著增加(扩展图1a)。E3泛素连接酶在Apc−/−类器官中表达增加(图1b)。与正常组织相比，只有RNF43和ZNRF3在人类结肠腺瘤中表现出表达增加模式（扩展图1b，c）。为了将这种表达模式与结直肠癌(CRC)进行比较，设计了Apc-/-类器官，添加相关的结直肠癌（CRC）突变，并引入KrasG12D (AK)、Trp53 (AKP)和Smad4 (AKPS)基因突变。原位移植AKPS类器官引起的癌的原位杂交显示肿瘤内两种连接酶高强度和均质染色(图1c)。因此，CRC中Wnt信号的过度激活导致RNF43和ZNRF3的表达增加。

图1 wnt响应E3泛素连接酶RNF43和ZNRF3可降解IGF1R

扩展图1 IGF1R与wnt响应E3泛素连接酶RNF43和ZNRF3二聚导致IGF1R降解

RNF43 和ZNRF3 降解 IGF1R

CRC中APC的普遍缺失使得肿瘤Wnt配体独立，绕过了RNF43和ZNRF3的调控活性。假设这些连接酶可以被用来选择性地降解wnt高度激活肿瘤中的其他底物。为了证明这一概念，作者集中研究了胰岛素生长因子1受体(IGF1R)。将二聚结构域(DmrA和DmrC)融合到各自的蛋白质上，添加一种二聚的化学诱导剂(A/C异二聚剂)来探索连接酶-IGF1R共定位的效果(图1d和扩展图1d)。A/C异二聚体处理诱导RNF43-DmrA或ZNRF3-DmrA与IGF1R-DmrC的剂量依赖性结合。并且异二聚伴随着IGF1R-DmrC蛋白水平的浓度依赖性下降(图1e和扩展图1e)。为了将这一发现转化为治疗形式，作者生成了双特异性抗体，将靶向gD表位的抗体臂与七个之前建立的IGF1R抗体配对，跨越一系列的亲和性和表位(图1f和扩展图1f,g)。将该PROTAB加入表达融合gD的RNF43或ZNRF3细胞中，细胞表面的IGF1R被有效降解，而没有表达E3连接酶的细胞不受影响。后续证明连接酶-靶点的二聚化可以介导靶点降解，但降解能力和抗体亲和力并不完全匹配，可能是因为三元复合物的空间结构也会影响蛋白降解。(图1g-i)。这些结果表明连接酶-靶标二聚可以介导靶标降解。值得注意的是，IGF1R靶向抗体的亲和力并不能完全预测细胞表面清除，这表明表位——以及三元络合物的几何形状——可能会影响靶标降解。为了将这种方法扩展到内源性连接酶，开展了针对RNF43和ZNRF3细胞外结构域(ECD)的抗体发现活动(扩展数据图2a)。在开发了gD结构依赖的抗体后，作者又尝试将PROTAB应用到内源性连接酶中，针对ECD建立了一系列的PROTAB。将这些抗体的一个子集与cixutumumab (Cixu)配对(图2a)，Cixu*gD PROTAB(即具有Cixu和gD识别臂的PROTAB)。在过表达连接酶的HT29细胞中，IGF1R细胞表面清除效率与连接酶结合臂的亲和力相关，在1nM左右达到平台期(图2b,c)。在IGF1R上含有N-末端荧光素酶tag21（HiBiT）的HT29细胞中评估了内源性连接酶的活性（扩展图2b）。用化学发光作为IGF1R细胞表面水平的指示物，IGF1R PROTAB导致了大量的IGF1R表面清除(图2d和扩展图2c)。用ZNRF3*IGF1R双特异性PROTABs处理HT29 HiBiT-IGF1R敲入(KI)细胞24小时后的细胞表面IGF1R水平。该图描述了一次筛选活动的IGF1R清除情况，并叠加了技术重复的值。重点介绍了随后使用的检测对照和PROTABs。分析显示IGF1R降解呈渐进性、剂量依赖性和可逆性，治疗后24-48小时内观察到清除饱和（扩展图2d，e）。定量生化分析示(图2e和扩展图2f)，PROTABs在具有各种内源性连接酶水平的CRC系的综合面板上驱动了高效的IGF1R降解。尽管用Cixu二价抗体处理的细胞偶尔会伴随IGF1R降解，但连接酶驱动的IGF1R降解，特别是通过ZNRF3，似乎更明显(图2e)。在没有连接酶表达的细胞系中观察到有限或没有降解，如RKO细胞，它们没有致癌的Wnt通路激活(扩展图2g)。在缺少连接酶细胞表面表达的RNF43敲除(KO)和ZNRF3-KO HT29细胞中，IGF1R没降解(扩展图2h,i)。结果证明了PROTABs能够通过内源性连接酶来驱动IGF1R降解。有了具有良好特征的IGF1R PROTABs，我们接下来探索了它们的一些生物活性。首先，我们比较了IGF1R降解对SW48细胞中PROTABs和配体竞争igg之间下游信号事件的影响。作者探索了PROTAB的生物活性，Cixu*ZNRF3 PROTABs比Cixu单独抑制IGF驱动的AKT和S6磷酸化更有效(图2f)。号减弱也会影响体外肿瘤细胞的活力，特别是在低抗体浓度时(图2g)。评估了皮下移植SW48肿瘤小鼠静脉注射PROTAB后的活性，ZNRF3*IGF1R PROTAB单剂量(1mg/kg)可显著降解IGF1R，在最高剂量下，IGF1R降解被部分抑制（扩展图2j）。与正常组织相比，ZNRF3*IGF1R PROTABs对CRC具有肿瘤选择性（图2j)。这些数据表明，与相应的正常组织相比，ZNRF3*IGF1R PROTABs对CRC具有肿瘤选择性。

 

图1

扩展图1

图2 内源性RNF43或ZNRF3与IGF1R绑定可诱导靶标内化和降解

扩展图 2 RNF43和ZNRF3双价抗体运动有助于合理设计基于连接酶的双特异性PROTABs，其可将内源性RNF43或ZNRF3绑定到IGF1R

3． ZNRF3*IGF1R PROTABs的特征

接下去对降解机制进行研究，某些细胞系IGF1R:ZNRF3的比值大于400:1，仍然观察到有效的IGF1R清除，这意味着催化活性而不是化学计量活性(图3a和扩展图3a,b)。将重点放在HT29细胞中的ZNRF3上，此细胞很容易接受基因编辑。引入插入-删除突变(indels)来截断ZNRF3的n端结构域(ZNRF3 N-term(i))或RING结构域(ZNRF3 RING(i)) (扩展图3c,d)。ZNRF3 N-term(i)导致连接酶表达的完全丧失，ZNRF3 RING(i)与野生型ZNRF3相比增加了细胞表面表达可能是由于自泛素化缺陷(图3b)。两种细胞系中protab介导的IGF1R降解均被消除(图3c)。用PROTAB处理（ZNRF3（ΔRING））细胞和野生型ZNRF3，与野生型相比，ZNRF3(ΔRING)表达细胞中观察到IGF1R降解效率较低(扩展图3e)，残留活性可能归因于内源性连接酶。LRP6是ZNRF3的假定底物，与野生型和ΔRING蛋白共同沉淀（扩展图3f），表明RING结构域的缺失不会改变蛋白质的完整性。表明最佳的PROTAB活性取决于ZNRF3的环和C末端结构域。为研究目标降解途径，检测蛋白酶体抑制剂MG132和自噬溶酶体途径抑制剂巴菲霉素A1对PROTAB活性的影响。与典型的ZNRF3底物FZD和LRP相似，ZNRF3诱导的IGF1R降解是通过溶酶体途径介导的。观察到MG132短时间抑制蛋白酶体后IGF1R降解受损，其中溶酶体功能障碍(LC3B脂化监测)最小(图3f)。表明PROTABs可以参与这两种降解途径。后利用定量质谱法评估了PROTAB处理跨蛋白组的降解特异性。ZNRF3*IGF1R PROTAB显著降低了IGF1R水平，而二价Cixu抗体仅轻微影响IGF1R水平(扩展图3h)。除了IGF1R水平的变化，在Cixu或ZNRF3*IGF1R PROTAB治疗后，一些蛋白质也表现出下调，因此可能是IGF1R途径抑制的下游结果(图3g和“数据可用性”部分)。与内源性ZNRF3底物相关的多肽，包括LRP和FZD家族成员，在PROTAB处理后大量增加(图3g和扩展图3h)。总的来说蛋白质组学数据通过同时揭示内源性ZNRF3底物的稳定与特定的PROTAB靶向受体的减少，验证了PROTABs的特异性和作用机制。观察到PROTAB治疗稳定了FZD和LRP蛋白，促使评估它们对Wnt信号活性的影响。与验证过的Wnt激动剂相比，ZNRF3*IGF1R PROTAB处理导致Wnt活性适度增加(扩展图3i)。体内PROTAB治疗导致肠道中Wnt信号的轻微增加，已知的Wnt响应基因水平证明了这一点(图3h)。然而，在长时间的暴露中没有观察到肠道结构的明显影响(图3i)。综上这些数据表明所测试的ZNRF3*IGF1R PROTAB对Wnt信号激动和肠道内稳态的影响有限。

图3 | ZNRF3*IGF1R双特异性PROTABs通过连接酶依赖的方式诱导靶标降解

扩展图3 ZNRF3细胞表面水平和催化活性介导ZNRF3*IGF1R双特异性PROTAB诱导的IGF1R泛素化和降解

PROTAB 降解靶点的扩展

为了证明PROTAB的通用性，针对其他的膜相关蛋白进行降解。比如受体酪氨酸激酶HER2， ZNRF3*HER2 PROTAB在SW48细胞(扩展数据图4a)和皮下植入肿瘤(图4a)中导致HER2的显著降解。用ZNRF3*HER2 PROTAB处理正常和患者来源的CRC类器官导致肿瘤特异性降解，而抗HER2二价抗体导致正常细胞和肿瘤细胞的降解(扩展数据图4b)。接下来生成了靶向程序性死亡配体1 (PD-L1)的PROTABs, PD-L1驱动癌细胞的免疫逃避。尽管二价抗PD-L1在体内或体外对PD-L1水平没有显著影响，但ZNRF3*PD-L1 PROTABs治疗导致受体几乎完全降解(图4b和扩展图4c)。与IGF1R类似，PD-L1降解依赖于ZNRF3的催化活性，并通过蛋白酶体和溶酶体途径进行(扩展图4d,e)。这些结果证明了使用PROTAB技术靶向多种治疗相关细胞表面蛋白的潜力。

图4 多个细胞表面E3泛素连接酶可以降解质膜靶点

扩展图4 ZNRF3 PROTABs靶向内源性HER2和PD-L1并降解蛋白

连接酶的扩展

细胞质连接酶降解平台利用有限数量的E3泛素连接酶，部分原因是难以获得高亲和配体。我们试图探索PROTABs是否可以利用更广泛的细胞表面E3泛素连接酶。在449个已知的E3泛素连接酶中，我们确定了38个假定的细胞表面E3泛素连接酶，由信号肽的存在、跨膜结构域和/或预测的或已知的质膜定位确定(扩展数据图5a,b)。defined by the presence of a signal peptide, transmembrane domains and/or predicted or known localization to the plasma membrane。针对与RNF43和ZNRF3具有相同序列、结构和结构域结构相似的连接酶，我们生成HT29诱导细胞系，表达n端gD和c端flag标记的连接酶，并通过流式细胞术检测其细胞表面表达。与gd标记的RNF43和ZNRF3相似，我们使用抗gd抗体在细胞表面检测到许多新鉴定的连接酶(图4c)。为了评估这组细胞表面连接酶是否能降解非天然靶标，我们用gD*IGF1R PROTABs处理HT29 gD - ligase - flag细胞，并监测IGF1R水平。WB证实将经验证的细胞表面E3泛素连接酶与IGF1R共定位驱动降解（图4d）。相反，流式细胞仪检测不到的连接酶不会诱导靶细胞降解(扩展数据图5c)。通过探索HER2、PD-L1和FZD5的蛋白降解，进一步评估了PROTABs平台的通用性，这三种治疗相关的癌症靶点包括不同家族的膜受体（分别为受体酪氨酸激酶、免疫球蛋白和G蛋白偶联受体）。与IGF1R类似，以gD表位为靶点的PROTABs可以驱动靶向受体的清除(图4e和扩展数据图5d,e)。值得注意的是，一些新鉴定的细胞表面E3泛素连接酶表现出离散的组织表达模式（扩展数据图5f），表明ZNRF3*IGF1R PROTABs所见的组织特异性降解可能适用于其他连接酶。综上所述，我们的数据强调了PROTAB平台在重利用多个细胞表面E3泛素连接酶作为质膜蛋白按需降解物方面的范围，从而使PROTABs具有广泛应用于各种治疗领域的潜力。

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扩展图5 细胞表面E3泛素连接酶的鉴定和改变PROTABs有助于平台扩展

优化PROTAB

在展示了该平台对多个细胞表面连接酶和靶标的可扩展性后，作者研究了是否可以通过蛋白质工程增强靶标降解。提升RNF43*IGF1R PROTABs的活性(图4f)。用2+1 fab - igg研究价性影响(图4g)。在异位连接酶表达的HT29细胞中，与两个IGF1R拷贝的结合与标准双特异性PROTAB的分化极小(图4g)。结合两个连接酶副本确实增强了清除能力;它也降低了细胞表面RNF43的水平，可能通过诱导反式中的自泛素化(图4h)。接下来，设计单臂Fv-IgG格式，以验证结合抗原之间的距离可能影响泛素转移和目标降解动力学的假设。IGF1R-RNF43 Fv-IgG在同时表达异位和内源性连接酶的HT29细胞中驱动更高的清除(图4i和扩展图5g)。而反转取向导致对IGF1R失去亲和力，并没有显著改善清除(图4i和数据未显示)。Fv-IgG增强了IGF1R降解的初始速率(扩展图5h)和与标准的一个靶标加一个连接酶双特异性PROTAB相比的最大降解速率(图4j和扩展图5i)。因此仔细优化抗体亲和力、形式和表位对于实现许多感兴趣靶点的有效降解至关重要。总之，作者开发了一个PROTABs平台，抗体诱导细胞表面E3泛素连接酶活性，进而驱动跨膜蛋白的高效泛素化和降解。PROTABs可广泛应用于跨膜受体和表面E3泛素连接酶，能够实现组织特异性降解。尽管PROTAB平台的治疗潜力尚未确定，但作者认为，该技术加上模块化抗体工程，为膜受体功能提供了更多的机会，这将应用于基础研究和治疗。

图4

扩展图5