SCIENCE ADVANCES丨基于DNA的具有可编程材料性能、组成和功能的工程合成凝聚物

大家好给大家分享一篇10月14日发表在《Science Advances》(科学进展)上题目为Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities（基于DNA的具有可编程材料性能、组成和功能的工程合成凝聚合物）。

生物分子的凝聚物参与到许多细胞过程中，从细胞调控到压力应激。自上而下的工程化合成凝聚物帮助我们对凝聚体组织原理的理解。也能赋予人工合成系统新的功能。然而，构建具有可预测组织和功能的合成凝聚液仍然具有挑战性。本文，通过DNA作为模块通过相分离产生凝聚物。DNA分子间相互作用的可编程性使其能够控制各种凝聚合物的性质，包括装配、组成和功能。与细胞内凝聚物的组织方式相似，DNA装载物也是选择性的被装载进同源凝聚体。本文证明了合成的凝聚体具有加速DNA链置换反应和通过浓缩特定反应组分的逻辑门操作。同时作者设想基于DNA的凝聚物可以帮助实现构建更高阶的合成的类生命体。

生物分子的相分离正逐渐成为细胞内一种基本的组织原理。在过去的几年里，大量的研究表明，细胞利用相分离形成浓缩特定不同凝聚物的机制，并促进所需的生存和增殖细胞反应。细胞内凝聚物的实例不仅包括典型的无膜细胞器如核仁、核斑点、胞质内应激颗粒，还包括了最近描述的一些结构，如转录，突触和信号簇。每个凝聚物通过控制其特定成分来实现不同的细胞功能。虽然还有许多有待研究，但一个瞬时多价分子间相互作用网络似乎决定了凝聚物的组成和组织。纳米尺度的分子间相互作用如何产生微米尺度凝聚物的丰富多相行为，由于其内在的复杂性，经常被与蛋白质-蛋白质相互作用相关的内在复杂性所阻碍。

作为构建模块，DNA提供了具有热力学稳定性和其精确定义的线性序列的特异性的分子间相互作用的独特优势。这些显著的可编程性已经在大量的例子中得到广泛的证明，例如，DNA链的混合自我组装成复杂的三维结构。序列的可编程性最初用于构建静态机构，后来很快用于构建动态程序。特别是，DNA链置换反应的演进为涉及DNA链动态交换的广泛应用开辟了新的途径，包括分子计算、可控水凝胶和自主纳米机器。值得注意的是，在大多数例子中，组装的DNA结构无论在溶液还是固体衬底表面上都作为孤立的单元发挥作用。然而，在细胞内凝聚物中，组成大分子松散地结合在一起，通过瞬态交换，使他们的相对位置配置发生重拍。这种动态的内环境促进了各种生还反应如核糖体的生成、RNA转录和DNA修复。

基于沃森-克里克碱基配对的生物分子相分离已经被应用于组装细胞内分子凝聚物。也被证明与有限价的DNA纳米结构有关，成为DNA纳米星。DNA纳米星中的自连接相互作用是由每个臂末端粘性末端介导的，这一特征对研究分子间相互作用和宏观热力学之间的流变特性的关系非常有用。DNA纳米星系统的相行为与低价相关联共存区域的缩小并伴随出现一个平衡胶。最近的几个工作开始开发基于DNA序列的可编程性来构建多相DNA液滴，并研究在其中的划分结构。但是，以DNA为基础的凝聚物模拟细胞内对应物的功能还没有实现。

本文，作者展示了一个基于DNA的合成凝聚物平台，该平台可以依据凝聚物单个序列来合理设计其组成和功能。灵感来源于细胞内凝聚物的组织和功能图（图1A）,本文的DNA凝聚物是由DNA支架作为驱动相，其中装载的货物装配体赋予特定的功能（图1B）。作者证明了凝聚物的凝结和溶解是否可以通过作用于支架的特定信号来控制。此外，作者还表征装载配体链选择性进入特定凝聚物的动力和热力学特征（图1C）。结果进一步表明，DNA凝聚物以一种高度选择性的方式极大地加速涉及DNA链置换反应的分子计算，这可能用于编码与反应耦合的复杂相行为。该工作为设计和建造合成凝聚物奠定了基础，这对于建造更像生命的人工机器至关重要。

结果：

1，基于DNA的合成凝聚物的设计

本文作者构建的基于DNA的合成凝聚物系统是借鉴活细胞内凝聚物的组织方式。生物分子凝聚物通常表现出一组独特的内部成分（图1A）,很大程度上分为两种类别：支架和货物装配体。支架驱动相分离，它们具有自连性质，对于凝聚物的形成和分子间的强度是必须的，支架间的相互作用通常是生物调节的目标，用于调节相分离的过程。相反，货物装配体不能单独诱导相分离，但可以通过改变它们的组成来定义凝聚物的功能。装配体与支架之间的分子相互作用推动装配体对凝聚物的划分。

作者采用和细胞内分子的类似的组织方式应用于基于DNA的合成凝聚物平台。利用DNA链分子间相互作用的可调性，设计了基于DNA的支架和装配体（图1AB）。支架具有自连性能并且可以和装配体结合。为了实现自连，作者这里采用了比较成熟特征明确的Y型纳米星来构建支架。Y型支架有三条带有回文粘性末端的臂，为了使能够结合装配体，在Y型支架上每个臂加上一条ssDNA单链并在臂的中间伸出toehold。该ssDNA除了作为装配体的结合点，也作为控制凝聚物的粘性末端。无论作为装配体的toehold还是粘性末端都是ssDNA的一部分称为组装子（assembler）（图1A）。因此，利用toehold可以介导链置反应，可以将组装子从Y支架核心上释放，导致凝聚物的溶解。这使得基于DNA的凝聚物能够实现信号依赖的控制。另外该系统中，任何和中间装载装配体的ssDNA互补的DNA元件都可以被装配，本文主要使用长度不超过50nt的ssDNA或dsDNA作为装配体。在基于DNA的凝聚物中，粘性末端和toehold的序列是可以选择的从而实现对凝聚物及其组分的相分离行为的正交控制。

 

图1，基于dna的合成凝聚物的可编程组织和功能

2，基于DNA凝聚体的可调相分离行为和材料特性

首先表征了Y型支架的相分离行为。为了组装支架，将Y支架的链等摩尔混合95℃孵育，之后梯度退火至室温。然后利用带有控温装置的共聚焦显微镜来检测温度对凝聚物的影响，由于Y支架自连是通过回文粘性末端杂交介导的，预计温度会很大程度上影响直接凝结。结果也显示在高温60℃没可见结构存在，但在低温30℃产生微米尺度的凝聚物，可以观察到凝聚物Y支架浓度高于周围空间浓度（图2A）。为了测试凝聚物液滴形成的浓度依赖性，测试了不同浓度下的Y型直接进行成像，随着浓度的增加，凝聚物由无到有，并且凝聚物的体积分数逐渐增加（图2B）。这与在细胞内广泛观察到的二元相分离行为一致。随后为了验证基于DNA凝聚物的流动性，做了FRAP实验，结果显示在相对高温40℃具有流动性呈现液滴性能，在较低温度4℃几乎无流动性（图2C）。这些数据与之前已知的DNA纳米星溶液的流导动行为一致，在从类流体状态逐渐转变为类固体状态。

盐浓度对Y支架结构有很大影响（图2D）。在FRAP实验中，荧光逐渐恢复随着盐浓度的增加而减慢(图2E)。在低盐浓度(200 mM NaCl)下，呈进行性生长具有反毛细管速度的凝析物形状的松弛约0.36 min/m(图2,F和G)，与先前报道相似(40)。

 

图2，Y型支架的相分离行为

3，DNA凝聚物的凝结和溶解的控制

随后，作者探讨了基于DNA凝聚物的凝聚和溶解的可控性。多价大分子之间的分子连接性是影响多价大分子液体凝析的稳定性的关键参数。与这一想法一致，我们发现Y核心与包含黏性末端的组装链的摩尔比对凝集物的形成至关重要。对于等摩尔的Y核心和组装体的混合物没有观察到冷凝，而在三倍过剩的组装体的混合物中发生了强烈的冷凝。

这可能反映了Y核心和组装器之间杂交平衡的结果。当凝析物被流动的装装配体动态诱导进入含有Y支架的样品时，我们观察到，富集了这两种成分的DNA凝析物逐渐沉降到成像室的底部，同样以化学计量依赖的方式(图3 B和C)。

凝聚物形成最小三价要求的要求表明,从每一个Y支架中移除一个单一的粘性末端,将大大减少其与其他支架进行交互连接的能力,并最终导致冷凝溶解。为了验证这一观点,作者研究了一种溶解链的凝析稳定性。因此,溶解器（dissolver）可以与Y脚手架的toehold区域结合,然后经过链置换,最终从Y支架架中取代组装子（图3A）。将溶解器添加到含有凝聚物的室内,导致单个凝聚物的逐渐溶解（图3D）。溶解器浓度越高凝聚物溶解的速度越快，同时作者对凝聚物的溶解进行了量化（图3E）。

为了进一步探讨冷凝的溶解机理,测量了冷凝体的溶解率,系统地改变了支架和溶解器的浓度（图3 FG）,发现支架浓度对凝聚物的溶解影响较小，而溶解器的浓度对凝聚物的溶解起到决定性的作用。

图3，对DNA凝集物的凝结和溶解的控制

4，DNA凝聚物的组成控制

细胞内凝聚物通过隔离关键调节成分促进生化反应发挥不同的生理作用，本质上，这两者都是由特定分子富集到凝聚物中驱动的。在本文DNA凝集物中，Y 支架具有控制凝集物组装和组成的双重功能，具有互补序列的装载配体可以与这些凝集物结合(图1 BC和4A)。我们将没有与toehold互补的序列区域的DNA称为无关配体。因此，在同时含有装载配体和无关配体的混合物到冷凝液中，被设计的Y型支架只选择性地只富集装载配体。

首先探测装载配体扩散到Y支架冷凝液的时间尺度。当装载配体和无关配体的混合物一起流入预组装的冷凝液时，我们观察到，随着时间的推移，装载配体被富集到冷凝液中，而无关配体被轻微排斥(图4,B-D)。最初，凝析液内出现浓度梯度，外围高，中心低，随着时间的推移逐渐衰减，形成均匀分布的浓度梯度(图4B)。约15分钟后，冷凝液中的配体浓度达到稳态值（图4C）。

在建立toehold介导的招募装载配体到凝析液体系之后，作者试图系统地改变toehold序列，并量化dsDNA客户在凝聚物中的富集。为了表征富集程度，计算了分配系数(PCs)，我们将其定义为凝聚物中装载配体端或支架浓度与凝析液中浓度的比值。发现装载配体受到toehold使用的特定序列的严重影响(图4E)。随着toehold的长度和G/C核苷酸占比的增加而增加。发现杂化的自由能变化是配体装载的决定因素(图4F)。

基于装载配体和支架之间的平衡结合，对分区行为进行了建模(11,65)。该模型成功地捕获了客户机分区数据的几个关键特性（图4G）。

结合强度对相分离的强烈影响表明，DNA凝聚物中装载配体的扩散流动性也高度依赖于所使用的toehold的性质。为了探测装载配体在凝聚物中的流动性，我们对不同装载配体进行了一系列的FRAP测量。我们再次发现，扩散速率和杂交自由能之间有很强的相关性(图4H)。通过不同的序列设计验证了装载配体装载到凝聚物中的正交性。装载配体与支架具有相同的粘端时，凝聚物会发生明显的溶解 (图4,I至J)。我们证明了我们的DNA凝聚物的组成可以使用toehold介导的装载配体分区进行精确定义同时保持凝聚液的整体完整性。

 

图4，通过装载配体的选择性分配来控制DNA凝聚物的组成

5，凝聚物介导加速的链置换反应

接下来，作者试图测试DNA凝聚物是否可以执行基于特定成分富集的功能。DNA链置换反应已被广泛用于构建反应网络，以执行不同的任务，如分子计算、自主步进和mRNA标记。因为本文的DNA凝集物可以集中特定的装载配体，我们推断DNA凝集物可以通过招募一组特定的装载配体来促进DNA链置换反应。作者设计了一个双级联DNA链置换反应，第一级联的单链输出作为下游反应的输入（图5A）。每个级联组件包含一个与Y支架的toehold结合的序列，我们可以通过荧光监测反应进展，荧光产生的原因是在级联末端，猝灭剂标记的链被报告链取代。

我们首先证实，在没有支架的情况下，设计的反应级联以依赖于输入的方式发挥作用。当在凝聚物存在的情况下重复相同的反应时，我们观察到反应大大加快（图5B）。凝聚物介导的级联反应速率提高了7倍。控制实验表明，反应加速只发生在分离成凝聚物的情况下;从支架上移除粘性末端的一端或相应的toehold都可以消除加速度效应（图5B）。为了进一步探讨两个共存相内的反应过程，我们使用共聚焦显微镜检测相同级联反应。证实DNA凝析物可以通过富集特定的toehold结合序列来显著加速链置换反应。

我们发现，即使在稀相，初始反应速率也比无支架样品高1.9倍（图5E）。为了详细探究这种影响，然后定量在没有支架的情况下，在反应组分的浓度相当于致密凝析液或稀释相的情况下的反应速率（图5F）。对于凝聚物相当条件，我们观察到与凝聚物相似的反应加速程度，表明仅质量作用即反应组分浓度的增加就能充分解释加速度效应（图5G）。这种行为可能是即使在不饱和状态下也倾向于存在溶液小的溶质群体团簇，通过脚手架组件可影响反应之间的结合。在sumo化反应中也观察到类似的行为和机制。

图5，凝聚物介导的链置换定量分析

为了检测支架和装载配体之间的结合强度对缩合物介导的反应速率的影响。我们首先证实，在没有支架的情况下，改变支架结合区域对链置换反应的影响很小。正如我们在本研究中所描述的那样，结合强度的增加会对凝聚物体系产生两种不同的影响:反应组分浓度的增加（图4 EF）其流动性的减弱（图4H）。这些特征将以相反的方式影响反应速率;增加装载配体分区可以提高反应速率，而缓慢的分子动力学则会产生不利影响（图5H）。与预期一致，发现装载配体和支架之间有一个最佳的结合强度G ~ 9.2 kcal/mol，反应运行最快。这些发现证实，反应组分与支架之间的强结合确实可以抑制分子扩散，减缓整体反应的动力学（图5I）。

6，基于凝聚物的逻辑门操作

DNA链置换反应作为一种基本反应被广泛应用于构建各种反应网络，用于分子计算等应用。作者测试了构建的基于DNA的凝聚物是否可以用于加速逻辑门的运算。为此，首先使用了一个包含12个DNA反应的双层或门（图6A）。当与凝聚物耦合时，我们发现电路的计算速度大大加快:根据输入类型的不同，反应速率增加了12到22倍（图6 B-D）。

为了进一步证明DNA凝聚物对分子计算的适用性，我们设计了一种基于冷凝物介导的反应动力学调节的门控机制（图6 E）。其中，两个级联通过共享一个中间门参与动力学门控，其余的级联作为旁观者。使用这个系统，我们确实观察到动力学门控成功地按照设计工作，显示出电路输出的明显差异取决于所使用的选择股的类型（图6 F-H）。在凝聚物的耦合上的选择器介导的反应，相应的反应急剧加速，伴随抑制另一个级联参与动力学门控。

最后，为了扩展凝析液的功能，我们利用了DNA液滴的不混溶性。结合本系统中凝聚物与装载配体之间存在的正交性，可以实现不同组分的多重不混相缩合物的组装。因此，本DNA凝集系统可以用来组织多相反应系统，类似于在活细胞中共存的各种功能性生物分子凝集物。为了以最简单的形式展示这一特征，我们准备了两组不同的支架和装载配体，以便每个冷凝液只招募一组反应组分。因此，本DNA凝聚物代表了一种可编程的不混相，它可以选择性地招募特定的成分，并促进它们之间的化学反应。

 

图6，凝聚物介导的分子计算

总结

细胞通过形成动态的无膜凝聚物，利用相分离机制来组织其包含物。特定的生物分子被招募到凝聚物中，相互作用以执行不同的细胞反应。在本研究中，作者引入了基于DNA的合成凝聚物来模拟细胞内凝聚物有组织和功能这种方法。利用DNA可编程的显著特征，作者设计了支架和转载配体的DNA链，它们一起自组装成功能性凝聚物。支架具有低价性，因此可以形成低密度凝析物，这种凝析物可以按需容纳短DNA装载配体。证明了在凝析液中选择性地分配和富集装载配体可以极大地促进DNA链置换反应，这是我们应用于分子计算的特征。因此，在之前的工作的基础上，本文的DNA凝聚物代表了一个可编程的平台，其组成和功能可以以可预测的方式设计。

在本文工作中，作者主要集中在展示基于DNA的合成凝聚物的合理性设计，但方法可以在几个简单的方式中扩展。虽然我们在本研究中使用了三支臂的DNA支架，因为它易于实施和对扰动的高敏感性，但更高价的支架可以产生具有不同物理性质的凝析液。这将允许在更高的温度或更大的浓度范围下操作凝聚物，可能会有不同的反应速率。此外，我们希望我们在这里提出的技术也可以用于建造多模态凝聚物。与自然凝聚物的作用方式相似，合成DNA凝聚物可能释放信号，例如，可以作用于溶液或其他凝聚物中的其他DNA回路。

作者还设想基于DNA的凝聚平台可以提供复杂的高阶函数运算，这是稀释状态下生物分子无法实现的。期待DNA的独特优势，包括分子间相互作用的序列可编程性、生物相容性以及易于与其他生物分子或纳米材料界面，将使其成为构建更类似生命的合成系统的重要组成部分。