NAT COMMUN丨使用单分子共定位提高免疫检测的灵敏度和特异性
大家好，今天为大家带来的一篇文章是由Prof. H. Tom Son发表在nature communication上的一篇文章，Improved immunoassay sensitivity and specificity using single-molecule colocalization。主要是关于降低传统ELISA实验中的非特异性检测的问题。
酶联免疫吸附测定（ELISA）仍然是基础研究和临床诊断中蛋白质生物标志物检测的重要工具，由两种不同的抗体以“三明治”形式捕获和标记靶标，但这种方法存在非特异性吸附的问题，尽管可以通过洗涤和改变检测抗体的浓度来减少非特异性吸附的问题，但灵敏度与特异性难以得到有效的平衡。
在这项工作中，作者描述了一种双色三明治免疫测定法，该测定法可区分特异性和非特异性结合，并可应用于多种蛋白质分析物。SiMCA采用已用不同荧光团标记的 cAb 和 dAb，使用全内反射荧光（TIRF）显微镜成像，通过丢弃未与cAb对应物共定位的dAb分子，可以大大减少由于非特异性结合而导致的背景信号，从而改善信噪比，降低检测限（LOD），并提高分析物校准曲线的准确性。除了非特异性 dAb 结合外，异质性 cAb 表面负载也会对测定变异性做出重大贡献。单分子成像使作者能够将每个视野的dAb计数归一化为cAb计数，从而克服了这种异质性问题。这种方法使实验中的信号灵敏度和一致性大大提高，即使在高背景环境中也是如此。例如，作者用一对表征良好的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体证明了SiMCA，并表明，与使用相同抗体的非共定位测定相比，作者可以在血清中实现低三倍的LOD（7.6±1.9 pM，26±5.8 pM）。此外，无论测定是在缓冲液，70%鸡血清还是70%全人血中进行的，作者的测量结果都保持一致。总的来说，这些结果表明，SiMCA可以克服非特异性结合带来的灵敏度和再现性限制，即使在高度复杂的生物基质中也能准确检测蛋白质的皮摩尔浓度。
SiMCA platform design
SiMCA是一种基于三明治的测定，其中cAb和dAb各自偶联到不同的荧光团标签上，并且仅当两个荧光信号共定位时才指示真正的结合事件（图1a）。作为证明，作者使用了一对特异性识别炎症细胞因子TNF-α的抗体。作者用绿色荧光团（Alexa-546）标记了cAb，并用生物素对抗体进行了位点特异性标记，以便它可以固定在链霉亲和素包被的表面上，同时确保抗原结合结构域被适当地定向以进行靶标结合。dAb用红色荧光团（Alexa-647）标记。
图 1：SiMCA 平台设计。
SiMCA 可减轻非特异性结合并提高再现性
众所周知，在ELISA中使用过量浓度的dAb可以极大地促进非特异性结合6，19.降低所采用的dAb水平可以缓解这个问题，但代价是由于信号损失而降低灵敏度。
作者首先评估了在没有TNF-α的情况下，在各种浓度的dAb下发生的非特异性结合的程度。作者将cAb包被的盖玻片用低（50 nM）或高（500nM）浓度的dAb孵育过夜，洗涤盖玻片以除去任何未结合的dAb。
当覆盖两个荧光通道时，大多数dAb斑点没有与cAb共定位（图2a，中）。（重叠的cAb和dAb斑点显示为黑点）。任何未在空间上覆盖cAb的dAb斑点都是非特异性结合事件，使用常规方法，这些点将被错误地计为结合事件（补充图2-4）。量化测量的dAb总数与在每个盖玻片的所有128个视野中与cAb共定位的数量相比，发现共定位可以消除几乎所有这些虚假的结合事件（图2b）。这些结果表明，SiMCA双色定位策略可以极大地减轻非特异性结合的影响。
单色方法对非特异性背景的敏感性因盖玻片异质性而进一步加剧，其中cAb在表面上的随机分布可能导致使用相同制备的盖玻片和样品观察到的共定位对数量的差异。为了探索这种效应，作者孵育了多个用cAb功能化的盖玻片，具有不同水平的TNF-α（0，100和300 pM）和50 nM dAb。量化盖玻片上每个视野 的dAb计数的绝对数量导致在 100 pM TNF-α 处具有高方差系数 （CV）（图 2c，左图），而仅计算共定位事件导致由于背景减少而导致的 CV 略低（补充图 6）。这种适度的减少归因于这样一个事实，即cAb计数在单个盖玻片内的多个视野以及盖玻片之间都存在很大差异（补充图7）。为了解释这种异质性，作者根据每个 视野 中的 cAb 计数对共定域 dAb 计数进行了归一化，其中归一化计数 1 是理论最大绑定，0 是理论最小值。这种归一化大大降低了信号方差，100 pM盖玻片的CV显着降低了4.8倍（图2c，右）。在300 pM TNF-α时，由于真实结合事件数量的增加，背景dAb信号的小数贡献有望降低。因此，绝对 dAb 计数以及共定位和归一化计数产生了可比较的 CV（图 2c）。由于将共定位和归一化相结合，在高背景条件下以及盖玻片中可显著提高信号一致性，因此作者将这种分析方法用于下面介绍的后续SiMCA分析。SiMCA能够消除检测抗体的非特异性结合产生的背景的混杂效应，并在达到pM检测限的同时大大提高测量的可重复性。
图2：共定位最大限度地减少了过量检测抗体的背景。
SiMCA 可降低缓冲液和血清中的定量误差
生物标本（如血清和血液）可产生特别高水平的非特异性背景，因为干扰蛋白表现出对dAb的交叉反应性或与测定底物本身结合。作者通过比较单色和共定位方法，在buffer和70%鸡血清中0-20 nM TNF-α的校准曲线时，评估了干扰物质如何影响SiMCA与传统单色测定的定量性能和精度（图3a）。作者使用鸡血清来模仿人类血清的复杂性，而不受内源性人类TNF-α20.
在ELISA中，通过使用两个拟合参数将Langmuir拟合到带有已知目标量的样品的数据中来实现定量：平衡解离常数（KD） 和最大结合量（Bmax).这些参数及其相关的不确定性用于估计特定置信区间内未知样品的浓度。当校准曲线具有不受样品矩阵影响的紧密参数拟合时，可以获得高置信度。更严格的参数拟合和更低的背景信号还有助于提高解析较低分析物浓度的能力，从而降低LOD。
使用buffer中的绝对 dAb 计数，作者推导出 KD的 404 ± 35 pM 和 Bmax 645 ± 16 个计数（图 3b）。在血清中，相同的分析产生明显不同的KD和 Bmax 649 ± 17 pM 和 446 的值分别± 3.4 个计数。LOD也增加了三倍，从缓冲液中的6.6±1.4 pM增加到血清中的19.4±4 pM。令人惊讶的是，血清中这些参数的CVs明显低于缓冲液。与单个视野和盖玻片的观察结果一致，归一化为 cAb 计数可纠正这种差异，强调盖玻片变化的重要性，如果不加以纠正，则盖玻片到盖玻片的变化是误差源。将共定位和归一化相结合，可生成更窄的置信区间以及 K 的参数拟合KD和 BMAX血清和缓冲液中几乎相同（图3c）。此外，作者观察到拟合参数的CV相对于绝对dAb计数得出的值低2.8-6.3倍，对于血清和缓冲液实验，这些值大致相当（见补充表1）。作者还在血清中实现了7.6±2.0 pM的低密度，而单色测量的LOD为19.4±4 pM。
图3：通过在缓冲液和70%鸡血清中的单色和双色分析定量TNF-α。
SiMCA 可降低复杂样品中的假阳性率
最后，作者开始定量评估单色与双色共定位方法的诊断敏感性和特异性，这些检测采用低浓度的TNF-α（0，10和100 pM）至70%鸡血清或70%的人血中。作为参考，TNF-α的生理浓度范围为基线时的4 pM对于发生脓毒性休克的患者，平均为 40 pM，最高可达 300 pM.在作者的实验中，血清和血液中的绝对dAb计数差异很大，一些分布严重偏斜，有长尾巴甚至双峰 - 这反映了盖玻片固有的异质性，如上所述。相比之下，归一化的共定位计数在缓冲液、血清和血液中明显更加一致。
为了评估共定位和归一化在潜在临床应用（即检测TNF-α）中的有用性，作者在具有TNF-α的分布和没有TNF-α的对照分布之间进行了单独的二元分类。这使作者能够通过ROC曲线来表征真阳性率（TPR或灵敏度）和假阳性率（FPR，或1-特异性）之间的权衡。作为参考，目标和对照分布之间几乎没有重叠的理想测定将实现高TPR和低FPR 接近左上角的完美判别（TPR = 1，FPR = 0）。具有较差辨别性的测定（即，为两个类别产生相似的分布）将具有更接近对角线（图4a中的虚线）的ROC曲线，相当于随机猜测。
在10 pM TNF-α下，对于在缓冲液中制备的样品，绝对dAb计数的ROC曲线和共定位，归一化方法相似（图4a）。然而，在70%血清或全血中，共定位，归一化的数据明显优于绝对dAb计数的数据，特别是在较低的FPR下，进一步突出了单色方法无法区分由背景dAb结合和盖玻片变异性引起的假阳性（图4a;补充图10）。此外，共定位、归一化的 ROC 曲线在缓冲液、血清和全血中基本相同（图 4a）。为了定量比较样品基质和TNF-α浓度的ROC曲线，作者计算了曲线下的面积（AUC）（图4b）。TNF-α浓度的增加导致AUC的显着增加，正如当分布因真实结合事件数量的增加而进一步分开时所预期的那样。然而，根据单色dAb计数计算的AUC值显着低于从血清和血液中的共定位，归一化计数得出的值。这种差异在10 pM TNF-α中尤为明显，其中覆盖玻片表面的非特异性dAb募集占总计数的很大一部分。总之，与传统的单色方法相比，SiMCA实现了一致且准确的分析物检测，该检测对复杂生物标本产生的背景信号具有较强的甄别性。
图4：在缓冲液，70%鸡血清和70%人血中使用单色和共定位方法区分TNF-α浓度。
总之，在这项工作中，作者证明了SiMCA可以克服非特异性背景的混杂效应，即使在高度复杂的样品基质中，也能准确，灵敏和可重复地检测皮摩尔蛋白浓度的检测。但是，SiMCA需要相对昂贵的显微镜设备，可以实现单分子灵敏度。
作者在这项工作的重点是了解和减少免疫测定中的一般误差源，而不是证明优于现有分子检测测定的灵敏度。
