CELL丨破坏自动抑制回路产生“开环杀伤力”以产生抗逃逸的抗病毒剂

​今天跟大家分享一篇今年5月份发表在Cell上的文章，题目为“Disrupting autorepression circuitry generates “open-loop lethality”to yield escape-resistant antiviral agents”。作者基于干扰病毒的转录负反馈环开发出了一类反馈干扰剂，其不但有强烈的抗病毒效果，且对病毒具有很高的抗耐药性，有望成为一种新的抗病毒甚至肿瘤的策略。文章的通讯作者是由来自格莱斯顿研究所(Gladstone Institutes)，病毒研究所的Sonali Chaturvedi和Leor S. Weinberger教授。

在生物界，基因的调控可通过一种负反馈机制来实现基因网络的内稳态，从而减少基因的异常表达。其中较常见的负反馈形式为转录负反馈，它是指靶蛋白作为反式元件与其自身启动子上的一段特异性DNA序列（顺式元件）相互结合，

这种蛋白质-DNA相互作用（PDI）可对基因转录实现负性调节。即当蛋白浓度足够高时，PDI发生的概率大大增加，而启动子的表达受到抑制；而当蛋白水平较低时，PDI发生的概率减少，启动子恢复活性基因表达持续，因而靶蛋白始终维持在一定表达水平。虽然这种遗传反馈回路在自然界中普遍存在，但目前针对该反馈回路相关的药物转化仍面临巨大挑战。

格拉斯通研究所的Leor Weinberger和Sonali Chaturvedi博士在文中首次提出，病毒的反馈回路可成为治疗病毒感染的新靶标，干扰负反馈环可产生“开环杀伤力”，且从药物耐药的角度出发，该策略理论上具有更高的耐药抗性，有望成为阻止抗药性产生的药物。对于大多数传统的抗微生物药物和抗肿瘤制剂来说，靶标分子只要发生微小突变就足以发生耐药现象，从而导致治疗失败，而破坏转录反馈则可对耐药进化制造出更高的障碍。因为要发生这种特异性的DNA-蛋白质进化通常需要同时分布在DNA和蛋白质之间的数十个突变，因此理论上产生耐药的速度相对于传统的药物应该更加缓慢，有望成为一种具有高抗耐药的单分子疗法。

基于以上理念，作者首先对此前在疱疹病毒巨细胞病毒（CMV）中发现的一种关键负反馈回路进行了验证。CMV是一种常见的疱疹病毒类型，IE86是一种病毒增殖所需要的蛋白，但对感染的宿主细胞具有细胞毒性，当IE86达到足够高水平时，病毒可通过自身的反馈回路使转录下调，直到IE86浓度下降。文中，作者针对该回路设计了一段双链DNA分子诱饵作为反馈干扰剂（FD），它在反馈环路中类似于顺式元件，能够竞争性地与靶蛋白结合，从而干扰正常的反馈回路并使IE86浓度飙升，最终在产生更多的病毒之前即摧毁受感染的宿主细胞。随后，作者在不同的疱疹病毒亚型及RNA病毒（SARS-CoV-2）中再次验证了FD的可行性。因此，FD有望成为一种新的防止耐药产生的新的抗病毒药物。

图1.(A) 疱疹病毒 IE（IE86 和 IE175）转录负反馈回路示意图; (B) 计算模型显示反馈干扰器可以有效地打破反馈并增加IE蛋白水平; (C) 治疗过程中出现耐药巨细胞病毒变异的概率; (D) 用于催化IE86C末端片段蛋白同聚的不同长度的DNA双示意图; (E) 在ARPE-19细胞 (“反馈报告细胞”) 中稳定表达的最小IE负反馈电路(MIEP-IE86-IRES-GFP), 负反馈中断对GFP荧光和细胞活力的影响; (F) 核转染后48h GFP表达，用Zombie Aqua分析转染96h后细胞死亡情况。

首先，作者基于耦合负-正IE反馈模型，通过模拟首先确定了DNA诱饵能够作为FD，并特异性地去干扰IE负反馈。随后通过GCV抗性计算模型评估了在治疗过程中病毒突变n与出现CMV变异耐药的概率，模拟结果表明，与传统抗病毒药物相比，要重新塑造特定的蛋白-DNA作用往往需要更大数量的病毒突变（n > 18）。基于以上对FD功效的计算预测后，通过IE86同源多聚体的结合测试筛选出了结合能力最佳的28-bp DNA duplexes作为FD。为了测试其是否能够真正破坏细胞中的反馈，作者采用了稳定转导的ARPE-19细胞系, 通过核转染构建了最小的IE86负反馈报告电路(MIEP-IE86-IRES-GFP)，它能够表达cDNA编码的全长IE86和GFP。细胞流式结果表明GFP的增加与IE86C呈正相关，且为浓度依赖性，证实反馈被有效中断，且能看到明显的细胞凋亡。

图2. (A)和(B) ARPE-19 cells核转染后细胞活性分析; (C) 反馈报告细胞核转染后差异富集基因的RNA-seq 热图; (D) 信号通路GO富集分析; (E)和(F) 细胞凋亡和TUNEL染色。(G) 用富含CpG的TLR激动剂(ODN 2216)或FD双链体诱导48小时后，qRT-PCR对TLR9的表达分析。

为了验证FD是否可能存在由DNA传感器激活的固有免疫或者相关炎症的风险，作者通过流式发现ARPE-19 cells在转染前及转染FD86和 FDScram 86后的细胞无明显的凋亡现象，表明FD86不会引起固有免疫及炎症反应。为了探索FD86诱导细胞死亡的机制，作者对细胞进行RNA-Seq分析，筛选出了649的差异基因，且大部分基因与细胞凋亡通路有关，提示杀伤机制可能为细胞凋亡。随后通过细胞流式检测了细胞中早期及晚期凋亡的相关标志物，进一步证实了FD86能够通过诱导细胞凋亡发挥抗病毒效应。

图3. (A)细胞流式显示反馈破坏导致CMV感染细胞中IE86过表达(B)ARPE-19 cells核转染TB40E-IE-YFP后，FD86或FDScram处理后YFP荧光成像; (C) FD86的剂量-效应曲线及对应的IC50值; (D) FD86对CMV不同滴度的抗病毒作用; (E) CMV感染细胞后不同处理诱导凋亡的检测；(F) 中断HSV-1的反馈导致 IE175在HSV-1感染的细胞中过表达。(G) Vero细胞核转染17syn+ IE175-YFP (MOI = 1.0)后，FD86或FDScram处理12h后YFP荧光成像；(H) FD175剂量反应曲线和相应的IC50值；(I) FD175对HSV-1的抗病毒作用；(J) FD86或FDScram在HSV感染的Vero细胞中诱导铁死亡。

接下来作者评估了在病毒感染的情况下破坏IE86的影响。作者首先验证了FD86并不会影响病毒感染的过程，随后用细胞流式及共聚焦分析表明在感染CMV IE86-YFP融合病毒的细胞中，加入FD86后IE86表达增加了10倍以上。剂量反应曲线显示FD86的IC50为0.95 nM，远低于抗病毒药物fomivirsen (IC50 = 30 nM)，只需25 mM即足以实现100倍的病毒复制抑制效果。并且在发生多重感染时，FD86仍有较好的病毒复制抑制效果。细胞流式表明FD86是通过诱导CMV感染的细胞过早凋亡从而降低整体的病毒滴度。随后作者在另一种疱疹病毒（HSV-1）中再次验证了FD能够有效抑制病毒的复制。         图4. (A)和(B) 临近细胞死亡检测；(B) ARPE-19 cells核转染FD后滴定CMV连续培养; (C) ARPE-19 cells核转染FD后滴定HSV-1连续培养;、图5. (A)连续培养示意图；(B) ARPE-19 cells核转染FD后滴定CMV连续培养; (C) ARPE-19 cells核转染FD后滴定HSV-1进行连续培养;

随后作者使用了表型和基因型抗性分析去评估干扰反馈回路是否对抗性进化制造了更高的障碍。连续培养实验表明，FD86在第一轮时即把CMV的滴度降低了100倍，并稳定地低于检测限滴度长达52天。即使在易发生耐药的HSV-1中，FD175同样能够有效的抑制病毒复制并长时间维持在检测限以下的滴度，而传统的药物ACV则在第二轮时即发生了耐药现象。这些数据表明这种开环杀伤力为耐药性的演变带来了更高的障碍。此外，作者考察了过度表达的蛋白是否会从濒死的细胞中释放出去，并对周围未感染的细胞产生细胞毒性。通过bystander co-culture检测发现FD介导的凋亡只发生在感染的细胞，对未感染的细胞没有杀伤作用，这可能是由于凋亡或铁死亡介导的细胞死亡具有完整质膜的特性。鉴于不会对旁系细胞产生细胞毒性，文章随后考察了FD与传统的抗病毒药物（GCV, ACV）联合用药是否有协同作用。结果表明，单独FD介导的抗病毒效果与GCV, ACV效果相当，采用联合用药（FD86+GCV和FD175+ACV）后病毒抑制进一步增强，表明FD介导的抗病毒机制与GCV和ACV不同。鉴于病因不明的疱疹病毒感染是一个重要的临床问题，作者考察了多重FD在混合感染情况下是否同样能够有效抑制病毒复制。qPCR结果表明，经过多重FD处理后，CMV和HSV-1的相对基因组拷贝数均显著降低。因此，FD能与目前的标准用药进行联合使用，以进一步增强抗病毒效果，在一定程度上解决病因不明的感染。

图6. (A) 小鼠 HSV-1 角膜感染模型示意图；(B) 角膜的YFP荧光图像；(C) 角膜中表达HSV-1 YFP的细胞定量; (D) 角膜HSV-1病毒滴度; (E) HSV-1病毒基因组DNA定量；(F) 小鼠 mCMV全身感染模型示意图；(G) 病毒 IE88和GpB mRNA表达；(H) FD88处理后DNA基因组拷贝数；(I) FD88处理后病毒滴度；(J)治疗后小鼠体重变化；

鉴于良好的体外抗病毒效果，随后作者考察了活体效应。结果表明，在HSV-1角膜感染小鼠模型中，FD175能够显著降低感染细胞的数量，角膜中的病毒滴度降低了150倍，病毒基因组复制减少约2个log。在小鼠的mCMV全身感染模型中，FD88能够显著减少病毒滴度，抑制病毒复制，并且减少了肝脏和脾脏中的传染性病毒颗粒，此外，FD88治疗后的小鼠体重与受感染的动物相比具有有一定的保护作用。因此，数据表明FD介导的开环杀伤能够发挥全身抗病毒效应。

图7. (A) 假定的SARS-CoV-2 转录负反馈电路示意图；(B) 转染了FDTRS或FDScram的Vero细胞感染SARS-CoV-2后病毒的NSP15, ORF1a, 和Spike RNA表达水平；(C) 12 h后膜联蛋白V表达情况; (D) TUNEL染色测定48 h后细胞凋亡情况; (E) 用 FDTRS或FDScram治疗后SARS-CoV-2的病毒滴度。

最后，为了测试开环杀伤力概念是否可以推广到抑制其他病毒，作者考察了 冠状病毒（β-SARS-CoV-2）中之前预测的一个自抑制回路。该回路涉及非结构蛋白NSP15与病毒基因组RNA (gRNA)上的转录调控序列(TRS)相互作用，从而抑制病毒蛋白gRNA复制、转录和下游翻译。作者筛选出了一段由TRS四聚体重复序列组成的24-nt RNA作为反馈干扰剂 (FDTRS)，结果表明FDTRS 能够诱导亚基因组和基因组病毒RNA的显著增加，包括NSP15、ORF1a和 Spike RNA，并且在感染细胞中诱导了明显的细胞凋亡。这些数据验证了此前在SARS-CoV-2中预测的负反馈回路，并表明破坏该回路会产生开环致死杀伤，从而在RNA病毒中产生抗病毒作用。

该文章首次提出反馈回路能够作为抗病毒感染的药物靶标，并可能成为抗耐药治疗的有效逃脱策略。