NAT METHODS丨利用PROBER技术鉴定活细胞中与特定DNA结合的蛋白

大家好，今天给大家分享的文献是Paul A. Khavari组的工作。Paul A.Khavari 是斯坦福大学医学院赫尔佐格教授，斯坦福上皮生物学项目创始联合主任。他是美国国家医学院的当选成员。这份工作的题目是利用PROBER技术鉴定活细胞中与特定DNA结合的蛋白。

细胞内基因表达调控以来转录因子与基因组DNA启动子的结合，既往研究转录因子与DNA的结合往往使用甲醛进行固定，将转录因子与DNA交联起来，然而这种方法往往会导致非特异性的结合、最终输出的数据有失真的情况。

图1. PROBER技术检测序列特异性DNA结合因子

作者在这份工作中使用了一个邻近反应酶BASU，这种酶可以将邻近的蛋白标记上生物素（图1）。作者将BASU这个酶和Gal4进行融合，使得其能特异性和Gal4识别的DNA基序UAS结合。作者构建的PROBER体系主要包括三个质粒，一个表达目标要研究的DNA序列，这个序列带有UAS序列，第二个质粒是BASU-Gal4，用来表达Gal4融合的BASU，第三个质粒是哥Driver质粒，用于表达SVLT酶，主要是为前两个质粒序列能表达服务的。将要研究的DNA序列插到第一个质粒后，BASU-GAL4就能和UAS结合，这样但凡第一个质粒上DNA element of interest 结合的蛋白都能被标记上biotin。另外，BASU-GAL4本身也会自标记上biotin，因此作者在BASU-GAL4上标记上HAtag，这样的话通过SA进行pulldown就能把所有标记biotin的蛋白拉下来，既可以进行wb进行简单检测目标蛋白、又可以通过质朴分析所有的蛋白。

作者首先做了三个验证性实验，分别验证YY1识别基序、NFKB识别基序、以及STAT1的识别基序，检测SA能否pulldown相应蛋白，作为对照作者还构建了scramble作为对照。结果显示YY1的识别基序能特异性的pulldown YY1蛋白，同时HA标记的BASU-GAL4也能被pulldown下来。接下来作者还测试了NFKB的识别基序，因为NFKB只有在加入TNFa时才具有转录活性，因此可以作为一个PROBER方法的特异性。结果显示只有加入TNFa后，NFKB才能结合其识别基序；类似的STAT1也是只有加入IFNR才有转录活性，因此只有IFNR存在时，STAT1才能被pulldown下来。

图2. PROBER联合质谱分析转录相关复合体

接下来作者对YY1识别基序结合的蛋白进行了质谱，通过SAINT统计方法分析这些蛋白与YY1的结合是否具有显著性差异（图2）。结果显示YY1、ZHX1、ZHX2这些蛋白都具有较高的富集，其中ZHX1、ZHX2蛋白都是与YY1有结合，因此是间接与YY1识别基序结合的。敲低YY1蛋白后，所有蛋白的富集都减少了。接下来作者分析了NFKB识别基序富集蛋白的质谱，结果显示加入TNFa后富集最多的是RELA即NFKB的亚基，而不加TNFa则富集蛋白较少。

图3. PROBER技术重现染色质与内源性蛋白互作

接下来作者想看一下这个方法是不是具有一定的区分性，作者根据数据库的结果选取了三段能与YY1结合的识别基序，BS1、BS2和BS3，分析这三段YY1识别基序结合蛋白的差异，作者采用PROBER方法构建了蛋白互作网络，并用STRING分析。作者还用ChIP-qPCR验证了这些结合（图3）。

图4. PROBER 提供了以 DNA 为中心的相互作用组视图

另外作者还比较了PROBER技术和传统的DNA-pulldown技术检测结果的差异（图4）。结果显示，通过DNA-pulldown技术鉴定的大多数蛋白质与 RNA 结合有关，而 PROBER 鉴定的蛋白质与转录控制有关。作者接着将PROBER法与BioID法进行比较，结果显示BioID法无法检测到NFKB与PHF21A的结合，而NFKB与PHA21A的结合已通过邻近反应证实。

图5. PROBER 差异检测转录因子和调节因子作为 SNV 的函数

作者接下来探索了PROBER技术是否可以定量分析单碱基突变的DNA motif结合蛋白的差异（图5）。作者构建了带有SNP突变的pBait载体，结果显示带有SNP突变的motif与野生型motif结合蛋白有显著的差异。最后，作者应用PROBER技术检测疾病相关的体细胞DNA突变后与蛋白结合的差异（图6）。

图6. 癌症相关热点突变中转录因子和调节因子的差异检测

 

综上所述， PROBER 提供了一种快速识别与活细胞中特定 DNA 序列及其变体相关的蛋白质的方法。