SCIENCE丨一种由CRISPR-RNA引导的，RNA激活蛋白酶，Craspase
大家好，今天分享的文章是2022年8月底发表在Science上的Craspase is a CRISPR RNA-guided, RNA-activated protease。
作者介绍
本篇文章来自康奈尔大学可爱龙课题组，可爱龙教授曾在加州大学伯克利分校求学期间师从Jennifer Doudna，她因在CRISPR/Cas9基因剪刀研究中的贡献获得诺贝尔化学奖。可教授实验室的主要研方向是CRISPR-Cas机制及基因组编辑应用于细菌免疫、宿主-病原体相互作用，以及RNA结构、功能和基因调控机制。本篇文章的第一作者胡纯一博士在该实验室担任博后期间有发表多篇关于CRISPR-Cas系统的机制、功能研究文章。
背景介绍
CRISPR-Cas系统是原核生物的一种获得性免疫防御系统：入侵者进入宿主细菌后，其基因被加工成间隔序列（spacer）储存在CRISPR重复序列之间形成免疫记忆；当再次侵入时，能迅速响应，识别外源序列并启动免疫反应。
CRISPR/Cas系统大体可以被分为两类, Class 1 (包含了type I, III, and IV), 和Class 2(包含了type II 和type V和type VI)，这篇文章是基于typeIII-E系统。在Class1 中, 对于外源基因组的剪切需要Cas蛋白复合物和引导RNA。
III-E型的效应蛋白是由多个重复相关的神秘蛋白（RAMP）结构域融合串联成一个巨大的单亚基，因而又称之为gRAMP（giant RAMP）。该CRISPR系统附近有一个命名为TPR-CHAT的蛋白酶，其成员通常催化靶蛋白中特定肽键的水解，是一种caspase-like肽酶。
研究结果
测定重组的模式生物Candidatus “Scalindua brodae”gRAMP (Sb-gRAMP)在不同功能状态下的冷冻电镜(cryo-EM)结构。
图1 gRAMP结构处于静息态、rna结合态和裂解后状态
放大观察结构细节， 5’手柄的两个核苷酸(5 ' A- 2C -1-3 ')具有碱基配对能力，能够起到一个引导区的作用，可以理解为PFS即前间隔序列侧翼位点，该序列起到的作用与PAM类似。
图2 crRNA的5'手柄
如何预防脱靶效应以及它的裂解机制是这项工作的研究重点之一。通过冷冻电镜对gRAMP多重功能状态的捕捉，发现了gRAMP的一段loop序列，称为门控环，它对靶向RNA序列起到筛选检查的作用。在静息状态下，门控环阻断guide-RNA的第一个片段和附近的Site 1裂解中心。这种结构阻碍了第一段的靶标和guide-RNA配对，因此门控环必须移动才能使位点1发生裂解（图3 A和B）。
作者用linker取代了门控环的末端，以评估门控环在目标RNA识别中的重要性。结果显示野生型gRAMP不结合或切割free RNA（仅前9nt碱基配对crRNA guide），而突变体能够有效地结合靶标RNA并裂解。实验表明，门控环在防止错配中起着关键作用（图3 C）。
总结得到了RNA结合Sb-gRAMP的机制模型，即静止的Sb-gRAMP是以自我抑制的状态存在，从而避免非特异性RNA的结合和切割。靶标RNA通过guide RNA的3'→ 5'方向进行互补配对，门控环会对最后seed区(guide RNA的第1-4位碱基)的碱基互补序列进行检验，如果靶向的RNA与最后seed区是互补配对的，那么门控环移动，形成guide RNA-target RNA完全互补配对的双链结构，激活gRAMP的两个RNase酶切位点,进行切割（图3 D）。
接下来，作者通过比较裂解前后状态了解裂解机制。作者在切割位点周围确定了多个可能有助于切割发生的候选残基，并在突变试验中验证。结果表明 Cas7.2中的D547和Cas11中的R294、D298、Y367和K371的丙氨酸取代消除了位点1的RNA切割。由于Site 1是由Cas11和Cas7.2中的残基组装而成，因此site1可能只有在靶标结合诱导的Cas11中的铰链运动后才会变得活跃。Cas7.3中D698A和D806A突变消除了位点2的分裂，但Cas11突变R323A和H328A不影响(图3H)。电泳结果显示这些突变体可能削弱或改变Sb-gRAMP的RNA结合模式。其中含有双突变R294A/D698A或D547/D806A的Sb-gRAMP能够与RNA结合，但不具 RNA切割活性。因此，猜测这种gRAMP突变体也许可以用于RNA编辑、标记或追踪(图3E-H)。
图 3 Sb-gRAMP RNP靶标验证及裂解机制
为了深入了解RNA引导的蛋白酶系统是如何工作的，作者捕获了Craspase在apo(静息)状态、PFS匹配的RNA目标结合状态和PFS非匹配的目标结合状态的低温电镜结构图。对于TPR结构，第一、二次TPR重复中的疏水斑块使疏水和主链氢键接触到gating loop的一部分，以及附近的Cas7.2环。CHAT的Y450和L499插入到gRAMP表面的疏水口袋中，促进了界面的形状互补。突变实验结果发现TPR界面的Y75A和F103A丙氨酸突变完全破坏了gRAMP与TPR-CHAT的相互作用，CHAT界面的A445R和L449A/Y450A突变严重损害了gRAMP与TPR-CHAT的相互作用(图4)。
图4 Craspase组装的结构基础
接下来，作者探究rna引导的Craspase蛋白酶激活机制。对Craspase静息，靶向“自身”RNA，靶向“非自身”RNA三种不同状态进行了高分辨的结构重构。发现在Craspase静息状态和靶向“自身”RNA时，其蛋白酶TPR-CHAT并未发生构象改变，而当Craspase靶向了“非自身”序列的RNA时，这种与guide序列的前两位碱基不互补的RNA会与蛋白酶亚基上的一段开关螺旋产生空间冲突，迫使开关螺旋进行结构重排并发生巨大的构象改变(图5A)。
通过原子分辨率的结构比较，发现和静息状态比，靶向“非自身”RNA时，蛋白酶开关螺旋的重排和构象改变，会进一步推动蛋白酶活性口袋的结构变化，导致催化中心His585- Cys627距离从6.6Å缩小到3.3Å，从而达到蛋白酶激活状态(图5B)。
此外，作者还设计了候选肽，探测Craspase中潜在的RNA引导肽酶的活性。在薄层色谱分析中，合成肽显示了craspase依赖性的裂解，并且在不匹配的PFS RNA底物存在时，活性比匹配的PFS底物更强(图5C)。
根据以上的实验结果，得出RNA引导的RNA识别调控Craspase蛋白酶活性的机制(图5D)。门控环移动间接确定，靶标RNA的序列互补是先决条件。NOT逻辑门避免被自身RNA激活。Craspase只在两个条件都为真时被激活。执行逻辑计算依靠螺旋开关实现，它的移动触发一个构象继电器，进而变构解锁TPR-CHAT挂锁，并开启蛋白酶活性。(图5E)
图5 Craspase蛋白酶激活的结构基础
最后，则是探索这个蛋白酶的底物是什么？Type III-E位点编码另外3个保守的蛋白质: RpoE和2个功能未知的蛋白质，分别为Csx30和Csx31。因为蛋白酶和它的靶点通常在基因组中共定位，作者在共表达实验中测试了Craspase蛋白酶对这些蛋白的活性(图6A)。靶标结合Craspase与携带突变的Craspase对比显示，完整长度的 Csx30显著减少，而完整长度的 RpoE和Csx31水平未受影响(图6B)，说明Craspase对Csx30具有蛋白水解活性。
体外实验也同样映证，纯化的Craspase将Csx30处理为两个不同的片段(图6C)，表明Csx30是Craspase的天然靶蛋白。而在与非目标RNA（NT）或与PFS匹配的目标RNA（NPFS）的条件下没有明显的切割片段积累(图6 D)。
由之前的报道可知，Craspase仅在二价阳离子条件下切割结合RNA，作者推断没有镁离子时，靶标结合Craspase时肽酶会保持活性。实验发现镁离子含量低的条件下Csx30的加工明显增加，反映了靶标RNA裂解关闭了肽酶。而在镁离子存在的情况下， Craspase变体（MUT）的肽酶活性不会受到损害(图6 E)。
由这些发现得到了相应的模型 (图6 F)，Craspase的肽酶活性通过靶RNA结合后，切割Csx30，分离出一大一小的片段。切割后的Csx30片段通过诱导免疫反应，对原生宿主产生细胞毒性。然后，Craspase通过靶RNA切割自我调节，肽酶失效。
图6 Craspase以rna依赖的方式水解切割Csx30
总之，这篇文章明确了gRAMP的RNA靶向切割机制，并且验证出Craspase是一个CRISPR RNA引导的蛋白酶系统，而Craspase的蛋白酶活性受到严格调控，其天然的底物是细菌体内Csx30。由于Craspase只在特定的RNA序列存在时才有活性，因而它在体内(如基因表达谱)和体外(如RNA诊断)生物技术应用中具有一定价值。
Hu, Chunyi et al. “Craspase is a CRISPR RNA-guided, RNA-activated protease.” Science (New York, N.Y.), eadd5064. 25 Aug. 2022, doi:10.1126/science.add5064
