NAT COMMUN丨用于肿瘤特异性蛋白质降解和精确癌症治疗的工程生物正交 POLY-PROTAC 纳米粒子
今天给大家分享的文献是2022年7月26日发表在Nature Communications上面的题为《Engineered bioorthogonal POLY-PROTAC nanoparticles for tumour-specific protein degradation and precise cancer therapy》的一篇文章。本篇文章由中科院上海药物所于海军研究员联合复旦大学附属中山医院徐辉雄教授，华东师范大学徐志爱教授发表。该研究在于海军课题组前期发展多种肿瘤微环境响应的智能递药系统基础上，创新性提出了一种聚合物化PROTAC（POLY-PROTAC）纳米治疗策略，实现了肿瘤特异性PROTAC递送和蛋白降解。
作者介绍：
研究背景：
1：PROTAC
蛋白质降解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimeras，PROTACs）可高效降解蛋白质从而实现多种疾病治疗，受到广泛关注。尽管前景看好，但传统PROTAC小分子的药代动力学行为并不理想，且缺乏肿瘤特异性，限制了临床应用。因此，精准递送PROTAC分子至肿瘤部位并有效降解瘤内目标蛋白，对于开发PROTAC抗肿瘤药物至关重要。
2：肿瘤微环境
胞内酸环境：正常生理环境下，血液中pH为中性；但肿瘤细胞增殖，通过糖酵解反应获能，该过程产生大量乳酸，导致胞内微环境有pH6.5-6.8的酸性。
胞内还原环境：肿瘤细胞中谷胱甘肽浓度比正常组织高1000倍左右，巨大的GSH浓度差，保证了还原响应的敏感性。使用二硫键，实现纳米组分的裂解，达到快速释药的目的。
胞外酶环境：MMP-2酶（基质金属蛋白酶2）作为辅助因子，在肿瘤侵蚀和转移中有重要作用，是肿瘤细胞微环境高表达的酶之一。
Scheme：
图1：用于肿瘤特异性蛋白降解和精确癌症治疗的POLY-PROTAC NPs示意图。
为实现PROTAC的精准肿瘤递送，研究团队首先合成了系列基于VHL配体的小分子PROTACs，通过将含有二硫键修饰的前体PROTACs连接在两亲性高分子聚合物上。该高分子聚合物可自组装形成均一稳定的纳米粒，且具有肿瘤细胞外酶环境，胞内酸环境和还原环境的响应性，从而该纳米粒可实现肿瘤组织的特异性聚集和高效渗透。
此外，研究团队对该纳米粒进行了叠氮化修饰以增加纳米粒在肿瘤组织的蓄积滞留。为此，研究团队设计了载有DBCO基团的预靶向纳米粒，该纳米粒可在肿瘤细胞外微酸环境下解离并暴露DBCO基团，从而通过click反应捕获叠氮修饰的POLY-PROTAC纳米粒。滞留的N3@POLY-PROTAC纳米粒在肿瘤微环境中过表达的MMP-2酶作用下实现PEG脱壳从而更易被肿瘤细胞摄取；进入细胞后，纳米粒的肿瘤细胞内微酸环境响应性使其解离并恢复其荷载的光敏剂焦脱镁叶绿素a（PPa）的荧光活性，与此同时过表达的谷胱甘肽（GSH）切断连接PROTAC分子的二硫键将其释放以降解目标蛋白。（图1）
结果与讨论：
1、PROTAC纳米粒的合成与表征
图2：BRD4 PROTAC和POLY-PROTAC NPs的合成和特征分析
BRD4 蛋白是溴结构域和超末端家族蛋白（BET）家族中最重要的功能蛋白，BRD4 的表达上调与肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关。选择VHL配体，调整其结构和Linker设计了4种靶向BRD4蛋白的POLY-PROTAC（图2a）。Western blot实验证实，所有四种PROTACs在体外均能显著降解MDA-MB-231乳腺癌细胞中的BRD4。且ARV771和MZ1比它们的类似物更有效地降低了BRD4的表达（图2b、c）。PROTACs的半抑制浓度（IC50)）比BRD4抑制剂JQ1低几十倍（图2d），表明BRD4降解剂比BRD4抑制剂更明显地损害了肿瘤细胞的增殖。将PROTAC分子与二硫键连接（图2e），HPLC检测显示，在用二硫苏糖醇孵育后，ARV771完成了再生，验证了二硫键连接的Me-ARV771还原敏感性（图2f、g）。
接下来通过PEG诱导的Me-ARV771和可酸分离的DPA单体通过纳米共沉淀的方法合成POLY-PROTACs：PD7(基于Me-ARV771)或PDM(基于Me-MZ1)。将酶响应的linker去耦连PEG形成PDG7。在中性条件下，根据透射电子显微镜可观测到，有球形纳米粒形成；但在PH=6的酸性环境，由于酸诱导的DPA基团的质子化，纳米粒出现解离（图2h、i）。
为证明POLY-PROTACs纳米粒的酸响应性，在纳米颗粒内包载光敏剂——焦脱镁叶绿酸（PPa），在中性条件下，存在FRET效应，荧光猝灭；在酸性细胞条件下，纳米粒解离，光动力活性被激活（图2j）。HPLC检测显示在GSH存在，即还原条件下，PROTAC得到释放（图2k）。这一现象证实了酸响应即还原响应的纳米粒的解离，以至于最终促进PROTAC在肿瘤细胞内的释放。
3、通过POLY-PROTAC NPs在体外降解BRD4
图3：可激活的POLY-PROTAC NPs在体外的细胞摄取、肿瘤渗透和BRD4降解性能
为证明MMP-2酶响应性的linker在增加细胞摄取方面的作用，用MMP-2酶预处理PDA7和PGDA7纳米粒后用分别去孵育MDA-MB-231细胞。流式细胞术和共聚焦显微镜分析，PGDA7纳米粒的细胞内摄取明显高于对照组（图2b、c）。证明MMP-2酶切断PEG促进了POLY-PROTAC纳米粒的内化。
后在体外三维MDA-MB-231肿瘤模型中研究了Ppa标记的POLY-PROTAC NPs的肿瘤穿透谱，根据CLSM图像，可得经MMP-2酶处理后的PGDA7纳米粒有显著的肿瘤细胞穿透能力（图3d-f）。且ARV771和MZ1的POLY-PROTACs在体外有效降解了MDA-MB-231肿瘤细胞中的BRD4蛋白(图3g-j)。与蛋白酶体抑制剂MG132共处理消除了PROTACs和POLY-PROTAC NPs如PGDM和PGD7)的蛋白降解能力(图3m)，验证了POLY-PROTAC NPs的泛素-蛋白酶体依赖的BRD4降解途径。
4、POLY-PROTAC NPs在体内的生物分布和抗肿瘤性能
图4：可激活的POLY-PROTAC NPs在肿瘤部位特异性积累及抑制肿瘤生长
接下来，在MDA-MB-231乳腺肿瘤小鼠体内模型中，研究了POLY-PROTAC NPs的肿瘤特异性积累和渗透。将PGDA7和MMP-2不敏感的PDA7类似物通过静脉注射给药，体内荧光成像及主要器官和肿瘤组织的荧光图像显示了POLY-PROTAC的肿瘤特异性分布，有MMP-2响应的PDGA7肿瘤组织荧光强度明显高于对照组(图4a-d)。且观察肿瘤体积、小鼠死亡率及WB结果验证靶蛋白的降解。发现相对于游离分子ARV771，PDGA7纳米粒有效降解了靶蛋白，抑制了肿瘤体积。同时发现，caspase-3的表达量也显著升高(图4e-i)。证实了有MMP-2介导的聚乙二醇链的断裂，致使纳米颗粒的肿瘤渗透性增加，且BRD4降解诱导肿瘤细胞凋亡。
- 生物正交click反应放大POLY-PROTAC NPs在体内的特异性分布
图5：click反应增加了体内生物正交的POLY-PROTAC NPs的肿瘤积累
为增加纳米粒在肿瘤组织的积累滞留，研究团队设计了载有DBCO的预靶向纳米粒。中性环境下，PED NPs与POLY-PROTAC NPs混合时，都是球形纳米颗粒，意味着其可以在血液循环过程中保持惰性；在酸性环境下，纳米粒发生解离，出现了尺寸分布广泛的无定形聚集体，电镜下证实DBCO与叠氮发生了click反应，形成了交联的纳米结构(图5a-f)。体内荧光成像及肿瘤切片的共聚焦图像显示有明显的瘤内荧光信号，证明PED NPs与POLY-PROTAC NPs实现了良好的共定位，且增加了POLY-PROTAC NPs的肿瘤渗透性（图5g-l）。高效液相色谱检测ARV771在体内的分布进一步表明，增加有预靶向纳米粒的实验组促进了POLY-PROTACs的肿瘤积累（图5m）。
- POLY-PROTAC NPs在体内抑制乳腺肿瘤生长
图6：POLY-PROTAC NPs与PDT结合，有效地抑制体内乳腺肿瘤的生长。
接下来研究POLY-PROTAC NPs在MDA-MB-231小鼠模型中的抗肿瘤性能（图6a）。相较于ARV771或N3@PGD7 NPs，PED+N3@PGD7更有效延迟了肿瘤生长（图6b、c）。为规避肿瘤细胞耐药性，将PED+N3@PGD7结合细胞内酸激活的光动力疗法（图6d），在671 nm激光照射下，PGDA7 NPs联合激活PDA-MB-231肿瘤细胞中caspase-3蛋白比PDT(Laser+PGDA)或BRD4单独降解PGDA7更有效(图6e)，表明PDT联合BRD4降解更诱导了细胞凋亡。后在体内研究了PDT联合BRD4降解的抗肿瘤性能（图6f），经证实，（PED+N3@PGDA7）和PDT联合使用显著抑制了95%的肿瘤生长，在小鼠肿瘤大小、小鼠体重及死亡率方面均表示出最优越的效果（图6g-o）。TUNEL染色及HE染色的肿瘤切片显示小鼠肿瘤细胞显著凋亡（图6j-i），WB结果证实体内BRD4的表达明显降低。综上，POLY-PROTAC NPs与PDT结合，有效地抑制体内乳腺肿瘤的生长。
总结：
该研究在课题组前期发展多种肿瘤微环境响应的智能递药系统基础上，创新性提出了一种聚合物化PROTAC（POLY-PROTAC）纳米治疗策略，使高分子聚合物自组装形成均一稳定的纳米粒，且该纳米粒具有肿瘤细胞外酶环境，胞内酸环境和还原环境的响应性，从而可实现肿瘤特异性PROTAC递送和蛋白降解。
