NAT BIOMED ENG丨石墨烯场效应晶体管固定CRISPR-Cas9用于检测未扩增的靶基因

作者：徐雪梅

大多数核酸检测方法需要大量试剂和昂贵笨重的仪器。在过去30年中，核酸检测技术，譬如常用的PCR技术需要将样本放大的多步反应，这个过程耗时耗物。因此，需要开发新的方法来克服传统核酸检测策略的局限性，以提供低成本和完全集成的紧凑型核酸诊断工具，扩大其临床应用。

在本工作中，作者开发了一种基于石墨烯的场效应晶体管（gFET），该晶体管借助于CRISPR技术来实现完整基因组中目标序列的数字检测。这种被称为CRISPR芯片的生物传感器将RNP复合物固定在晶体管上，使其具有基因靶向能力，由此得到一种无标签核酸检测装置，其输出信号可通过简单的手持读卡器测量。作者使用CRISPR芯片分析了从表达蓝色荧光蛋白的HEK293T细胞系中采集的DNA样本，以及杜氏肌营养不良症患者外显子两个不同突变的临床DNA样本。在含有目标基因的基因组DNA存在下，CRISPR芯片在15 min内产生灵敏度为1.7  fM的电流信号，无需放大，相对于缺少目标序列的样本，输出信号显著增强。CRISPR芯片扩展了CRISPR-Cas9技术在核酸芯片电检测中的应用。

CRISPR芯片这种生物传感器结合了CRISPR-Cas9的基因靶向能力和gFET的灵敏检测能力。石墨烯具有较高的载流子迁移率，对表面带电分子的吸附和相互作用非常敏感，能够方便、快速、选择性地检测完整基因组DNA中包含的目标序列（图1）。CRISPR-Chip是一种三端gFET，使用功能化石墨烯作为源极和漏极之间的通道。dCas9与靶向特异性sgRNA（称为dRNP）复合，被固定在gFET结构中的石墨烯表面。当实际样本被滴在芯片表面，固定化的dRNP扫描整个基因组DNA，直到确定其目标序列，解开双螺旋并与目标DNA进行动态结合。靶DNA与dRNP复合物的选择性杂交会调节gFET的电特性，并在15 min内产生电信号输出。

图1. CRISPR芯片在15 分钟内实现基因检测。

芯片电信号输出原理：如图2a所示，CRISPR芯片利用一个液栅电极，它与反应缓冲液中包含的基因组样本保持恒定接触。液栅和源电极（Vg）之间的外加电压控制石墨烯通道的源电极和漏电极之间的电流。带负电荷的DNA靶标与固定在石墨烯通道表面的dRNP的杂交不仅改变了通道的导电性，而且由于反离子的积累在石墨烯表面形成了一层离子渗透层以保持电荷中性。本体溶液和固定化离子渗透层之间离子浓度的差异产生了Donnan电位。这种额外的电位导致源电极和栅电极之间的电场发生变化，从而进一步调制石墨烯沟道电流，使传感能力超过德拜屏蔽长度。芯片制备成功并清洁后，在石墨烯表面通过π-π堆积修饰PBA分子，然后通过碳化二亚胺交联反应将dCas9固定在石墨烯沟道表面（图2b）。dCas9固定后再用氨基-PEG5-醇和乙醇胺盐酸盐进行石墨烯表面封闭，以防止带电分子的非特异性吸附。最后，固定的dCas9与一个特异于DNA靶标的sgRNA复合，形成锚定的dRNP复合物。

图2. 电信号输出原理及dRNP复合物锚定原理图。

如图3a所示，CRISPR芯片用于特异性检测bfp基因。使用dRNP-BFP功能化的CRISPR芯片的信号比非特异的dRNP-Scram功能化的CRISPR芯片有显著的电流信号响应（图3b）。电流实时监测实验（图3c）表明，在加入靶标基因2.5min时，便会产生电流信号响应。

图3. CRISPR芯片选择性检测基因目标bfp。

将CRISPR芯片应用在全基因组DNA样本检测中（图4）。将从正常HEK细胞中提取的基因样本作为对照，可以看出，CRISPR芯片对从表达BFP的HEK-BFP细胞中提取的基因样本具有很明显的电流响应（图4b）。此电流检测方法具有较低的检测限（200 ng target gene），且电流响应信号大小与bfp基因的数量有正相关关系（图4c）。图4d表示不同浓度的HEK-BFP对电流响应的实时监测，结果表明目标基因的检测限为2.3 fM。图4e、4f表示在900 ng bfp基因中加入0-1800 ng的非目标基因（HEK细胞中提取），用CRISPR芯片检测混合基因样本的电流响应，这一结果表明，CRISPR芯片在污染DNA浓度增加时的电流反应变化不明显。

图4. CRISPR芯片在全基因组样本中bfp靶基因的敏感性和选择性测试。

为了进一步验证CRISPR芯片在临床中的实用性，作者分析了其检测Duchenne型肌营养不良（DMD）相关突变基因的能力。DMD是由x连锁的肌营养不良基因突变引起的，它可以发生在所有79个外显子上，最常见的是2-10和45-55个外显子上的大缺失（图5a）。dRNP-DMD3设计用于靶向肌营养不良蛋白基因的外显子3，dRNP-DMD51设计用于靶向肌营养不良蛋白基因的外显子51，分别与从组织中提取的900 ng基因孵育并检测电流响应。如图5b、c、d、e所示，将电流响应阈值定为1.73%，正常人样本中外显子3或者外显子51的电流信号为阳性，即正常人样本中外显子3或51没有缺失，而DMD病人（A、B、C、D）为外显子3缺失者，D、E、F为外显子51缺失者。图5f表示对病人样本A的外显子51的灵敏性分析，检测限低至1.7 fM。对CRISPR芯片的再现性进一步研究，通过测量6个dRNP-DMD51修饰的CRISPR芯片分别与700 ng相同的基因模式样本孵育后的结果，图6g所示，6次测试结果相近，RSD = 10.6%，表明dRNP修饰的CRISPR芯片用于DNA分析的重现性较好。

图5. CRISPR芯片用于健康和DMD临床样本中肌营养不良蛋白外显子缺失的分析。

总结：石墨烯场效应晶体管生物传感器因其对无标签数字生物分子检测的高灵敏度和高能力成为生物传感领域的研究热点。本文利用RNP复合物作为石墨烯场效应晶体管生物传感器的特异性识别靶向元件，用于快速识别和定量目标基因序列。尤其是，CRISPR芯片利用液体栅石墨烯晶体管和扫描栅电压，可以减轻电荷屏蔽效应的限制，降低石墨烯生物传感器对德拜长度以外的结合事件的敏感性。其临床样本检测限亦比以前报道的用于检测全基因组中包含的目标序列的无扩增技术的检测限要低，而且此芯片仪器体积小，检测时间短，具有非常广泛的临床应用前景。

Reza Hajian, Sarah Balderston, Thanhtra Tran, Tara deBoer, Jessy Etienne, Mandeep Sandhu, Noreen A. Wauford, Jing-Yi Chung, Jolie Nokes, Mitre Athaiya, Jacobo Paredes, Regis Peytavi, Brett Goldsmith, Niren Murthy, Irina M. Conboy and Kiana Aran. Nature biomedical engineering 2019, 3(6): 427-437.