J Control Release丨适配体偶联纳米脂质体用于免疫原性化疗并逆转免疫抑制

今天分享的文献是近期在线发表在Journal of Controlled Release 上的一篇文章，标题为“Aptamer-conjugated nano-liposome for immunogenic chemotherapy with reversal of immunosuppression”。

有关作者：

本文的通讯作者是建国大学生物科学与生物技术系教授金东恩，近五年的主要研究方向是癌症治疗及适配体传感器。  

研究背景：

癌细胞具有各种免疫逃避机制，可通过重编程肿瘤微环境（TME）来抵抗免疫细胞。通过T细胞恢复抗肿瘤免疫反应主要有两种方法，一是抑制TME应答的免疫检查点封锁（ICB）点，可减少TME免疫抑制作用，但其临床反应局限于10–30％患者和特定类型肿瘤；二是诱导免疫原性死亡（ICD），ICD诱导剂募集免疫细胞改善免疫反应，但TME免疫逃避机制复杂，应用仍有挑战。

因此，本文开发一种纳米脂质体双重药物递送系统—APTM [DOX/IDO1]，基于阳离子脂质体载体与抗CD44/PD-L1 适体，携带ICD诱导剂（阿霉素，DOX）和IDO1 siRNA，联合免疫调节剂和常规化学治疗剂，是扭转TME多种免疫抑制活性并促进抗癌免疫反应的可靠方法。

图1. 通过抗cd44/PD-L1适配体偶联脂质体靶向的ICD诱导剂(DOX)和IDO1siRNA 共传递系统用于协同化疗免疫治疗的示意图

结果与讨论：

3.1.DOX诱导的ICD和IDO1上调

为研究DOX作为乳腺癌4T1肿瘤模型中ICD诱导剂功效，作者监测ICD生物标志物（ATP/CRT）和IDO1表达的水平，随DOX浓度升高，ATP、CRT水平逐渐增加，但CIS对照组处理下二者水平并未增加（图1A-D）；用4T1细胞进行疫苗接种实验并评估肿瘤大小，DOX处理下肿瘤生长较少（图1E-F)，DOX处理4T1细胞接种小鼠的肿瘤组织显示最高的IDO1蛋白和mRNA表达，表明了TME中ICD和IDO1表达之间的相关性（图1G）。

图2. DOX诱导的ICD和IDO1上调

3.2.同时递送DOX和IDO1 siRNA的脂质体载体

为制备Aptm[DOX/IDO1]，作者用荧光染料和硫醇基团修饰含有oligo-T连接体的抗CD44 /PD-L1 DNA适体5/3’端，通过硫醇-马来酰亚胺化学方法共价偶联到聚乙二醇化-DSPE胶束的马来酰亚胺基团上，并确定最佳N/P比（N =阳离子脂质的精氨酸氨基；P = siRNA的磷酸基团）为4：1，有效地将siRNA载入阳离子脂质体中（图2A-B）；接着将DNA适体连接到脂质体表面，通过凝胶-滤膜色谱法从游离核酸中纯化并测量Cy5.5标记DNA适体的荧光，CD44/PD-L1 Aptm比Lipm表现出明显增强Cy5.5荧光（图2C）；Lipm/Aptm [DOX/IDO1]都具有球形结构，且平均尺寸分布各为173 nm和183 nm（图2D）；Aptm[DOX/IDO1]的Zeta电位（1.31 mV ）低于Lipm [DOX/IDO1]（21.8 mV），以上结果均表明将DNA适体成功连接到Lipm表面（图2E）。

图3. APTM的准备和表征[DOX/IDO1]

3.3.APTM [DOX/IDO1]通过适配体介导的特异性结合和靶向细胞药物递送

为研究APTM [DOX/IDO1]与乳腺癌细胞特异性结合，作者用罗丹明分别标记Lipm、CD44 Aptm、PD-L1 APtm、CD44/PD-L1 Aptm 治疗癌细胞，CD44/PD-L1 Aptm 在CD44/PD-L1阳性乳腺癌细胞的外周和内部显示最高的罗丹明荧光，这表明，CD44和PD-L1特异性DNA适配体可有效靶向CD44/PD-L1阳性乳腺癌细胞。（图3A）。接着验证APTM [DOX/IDO1]由内吞作用将药物递送到靶癌细胞中Aptm[DOX/IDO1]显示最高DOX传递效率，且在CD44/PD-L1治疗前，抗CD44和抗PD/LD-L1抗体阻断靶蛋白显著降低了CD44/PD-L1 Aptm[DOX/IDO1]在靶癌细胞中传递效果，进一步证实Aptm[DOX/IDO1]靶向癌细胞传递DOX确实是由抗CD44和抗PD-L1DNA适配体介导(图3B)。

图4.适体介导的特异性结合和药物递送CD44/PD-L1适感体（CD44/PD-L1 APTM）

3.4.APTM [DOX/IDO1]传递的DOX和IDO1 siRNA的界面分布

为检测APTM [DOX/IDO1]传递的DOX和IDO1siRNA在胞内的分布，游离DOX迅速在核中积累，Lipm[DOX/IDO1]和Aptm[DOX/IDO1]传递的DOX主要分布在细胞周围和细胞质中，但随时间增加，Aptm[DOX/IDO1]传递大量DOX逐渐易位到细胞核中，Lipm[DOX/IDO1]传递的DOX仍在细胞外周和细胞质(图4A)；与Lipm[DOX/IDO1]处理相比，Aptm[DOX/IDO1]处理下IDO1siRNA被更有效地传递到的靶乳腺癌细胞中(图4B)。综上，Aptm[DOX/IDO1]通过CD44/PD-L1特异性DNA适配体有效靶向CD44/PD-L1阳性乳腺癌细胞的表面标记物，有助于将负载的DOX和IDO1siRNA靶向递送到乳腺癌细胞中。

图5. APTM [DOX/IDO1]传递的DOX和IDO1 siRNA的细胞内分布

3.5.Aptm[DOX/IDO1]的内吞作用和内吞体逃逸      

为评估Aptm[DOX/IDO1]内吞机制，作者使用多种内吞抑制剂阻断特定内吞作用途径，如氯丙嗪（网格蛋白介导的内吞作用）、阿米洛利（大胞吞作用）和丝状蛋白（小泡介导的内吞作用），流式细胞术分析显示，氯丙嗪起主要抑制作用，表明Aptm[DOX/IDO1]内吞作用主要是由网格蛋白介导的内吞作用，且氯丙嗪对Aptm[DOX/IDO1]内化的抑制作用明显大于Lipm[DOX/IDO1](图5A-B)。接着监测DOX和核内体/溶酶体分布来研究Aptm[DOX/IDO1]的核内体逃逸，Aptm[DOX/IDO1]传递的DOX广泛分布在细胞质中，而Lipm[DOX/IDO1]传递的DOX包裹在核内体/溶酶体中(图5D)。Aptm[DOX/IDO1]处理的细胞核内体/溶酶体中共定位的DOX斑点数量显著低于Lipm[DOX/IDO1]，且随时间逐渐减少，可能是其表面带负电荷的DNA适体的“质子海绵效应”引起(图5E)。这表明带负电荷的DNA适体可能通过增加质子缓冲能力表现出增强质子海绵效应，从而促进内体膜破裂。

图6. APTM的内吞作用和内体逃生[DOX/IDO1]

3.6. APTM [DOX/IDO1]在癌细胞中得到改良的抗癌功效

为研究Aptm[DOX/IDO1]抗癌作用，采用流式细胞术分析游离DOX、Lipm[DOX/IDO1]和Aptm[DOX/IDO1]处理的乳腺癌细胞凋亡，与Lipm[DOX/IDO1]处理的细胞相比，Aptm[DOX/IDO1]处理细胞的凋亡率显著增加（图6A）。接着评估DOX诱导的ICD，Aptm[DOX/IDO1]处理的乳腺癌细胞释放了大量ATP且CRT表达显著增加，均高于Lipm[DOX/IDO1]处理(图6B-C）。接着验证APTM [DOX/IDO1]可抑制乳腺癌细胞IDO1表达，Aptm[DOX/IDO1]处理下IDO1蛋白和mRNA表达均下调,而Lipm[DOX/IDO1]和Aptm[DOX/Ctr]分别缺乏靶向适配体和IDO1siRNA不能充分抑制IDO1的表达,这表明了Aptm[DOX/IDO1]通过提高药物传递效果，显著增加靶癌细胞中ICD，下调IDO1的表达（图6D-E）。最后评估Aptm[DOX/IDO1]传递的抗癌药物所引起的细胞毒性，Aptm[DOX/IDO1]处理在乳腺癌细胞中的活力显著降低，其程度与细胞活力最低的游离DOX相似,这说明Aptm[DOX/IDO1]对乳腺癌细胞的毒性大于Lipm[DOX/IDO1]，即Aptm[DOX/IDO1]比Lipm[DOX/IDO1]在靶乳腺癌细胞中表现出更高的抗癌效果(图6F)。

图7. APTM [DOX/IDO1]在人乳腺癌细胞中的抗癌作用

3.7.由Aptm[DOX/IDO1]系统输送DOX的生物分布和肿瘤生长减少

　　作者分析Aptm[DOX/IDO1]传递的DOX在小鼠体内生物分布，Aptm[DOX/IDO1]处理下的DOX在肿瘤中显著积累，且DOX的荧光强度随时间而增加(图7A)。接着研究Aptm[DOX/IDO1]在4T1肿瘤异种移植小鼠体内抗癌作用，作了５个处理：生理盐水、游离DOX、Lipm[DOX/IDO1]、Aptm[DOX/IDO1]、Aptm[DOX/Ctr]，Aptm[DOX/IDO1]给药最有效地地抑制肿瘤生长。当小鼠接受含有干扰siRNA而不是IDO1siRNA的Aptm[DOX/Ctr]治疗时，肿瘤生长抑制效果降低，表明IDOsiRNA通过抑制IDO1表达调节TME抑制肿瘤生长。(图7B-C)

因此，Aptm[DOX/IDO1]对4T1肿瘤异种移植小鼠肿瘤生长的抑制作用证明了其靶向传递。

图8. APTM [DOX/IDO1]在4T1肿瘤- Xenograpt小鼠中的生物分布和抗肿瘤功效

3.8. 抗肿瘤疗效是由Aptm[DOX/IDO1]在体内TME调节引起的

为评估Aptm[DOX/IDO1]的TME调节，作者用免疫组织化学染色和流式细胞术分析了4T1肿瘤异种移植小鼠中肿瘤浸润性CRT，CD8α，FOXP3，TNFα表达和成熟树突状细胞的比例，Aptm[DOX/IDO1]治疗主要增加CD8+CTL/CD11c+数量，而FoxP3+treg出现频率最低，这表明Aptm[DOX/IDO1]传递的DOX和IDO1siRNA可引起瘤内CTL和成熟DC浸润，但降低了TME中Treg比例；当小鼠接受缺乏IDO1siRNA的Aptm[DOX/Ctr]治疗时，随着FoxP3+Treg浸润的增强，肿瘤内CD8+CTL和成熟DC的数量减少，这说明IDO1的抑制对TME调节是必要的，即肿瘤浸润性CD8+CTL随着DC成熟度的升高而增加，但Treg的募集减弱。Aptm[DOX/IDO1]治疗的小鼠肿瘤中TNFα分泌高于其他组，这表明其浸润的CD8+CTL通过在TME中分泌TNFα表现出抗肿瘤作用，因此肿瘤生长的有效消退归因于协同的抗癌免疫反应，这是通过体内Aptm[DOX/IDO1]将免疫抑制TME转化为免疫促进TME。(图8A-B)。最后作者分析了小鼠肿瘤组织中IDO1的表达水平，Aptm[DOX/IDO1]治疗显著降低了肿瘤中IDO1的表达，但Aptm[DOX/Ctr]处理小鼠肿瘤中IDO1的表达水平显著增加，这表明IDO1siRNA抑制IDO1协同ICD反应逆转TME免疫抑制(图8C)；最后研究Aptm[DOX/IDO1]抑制小鼠肿瘤转移，Aptm[DOX/IDO1]处理的小鼠组织中未观察到转移性肿瘤。综上，Aptm[DOX/IDO1]可通过靶向传递抗癌药物靶向乳腺癌细胞来实现抑制肿瘤转移（图８D）。

图9. 4T1肿瘤 - 近代移植小鼠中APTM [DOX/IDO1]的TME调节

总结：

APTM [DOX/ IDO1] 是一种协同化学免疫疗法的纳米双重药物输送系统，通过全身循环在肿瘤部位特定药物递送和积累，抑制PD-1/PDL1相互作用，促进了ICD反应且IDO1敲低协同逆转了免疫抑制性TME，抑制肿瘤转移，可作为一种有前途的工具，用于肿瘤特异性多重免疫调节。