NAT BIOTECH丨通过蛋白水解靶向产生减毒的甲型流感疫苗
今天给大家分享的文献是2022年7月4日发表在Nature Biotechnology上面的题为《Generation of a live attenuated influenza A vaccine by proteolysis targeting》的一篇文章。本篇文章来自中科院深圳先进技术研究院合成生物学研究所司龙龙课题组，实验室致力于病毒感染和防治研究。
作者介绍：
研究背景：
疫苗是用细菌、病毒、类毒素等制成的可使机体产生特异性免疫的生物制剂，通过疫苗接种能使机体获得免疫力。用人工培育的方法，使细菌或病毒产生定向变异，从而大大降低致病性，这种致病性减弱的病原体制成的疫苗称为减毒疫苗。减毒疫苗仅是毒力大大减弱，但仍然保有免疫原性和繁殖能力。
PROTAC是一种异双功能小分子，分子的一端连接结合靶蛋白的配体，一段连接E3连接酶的配体，中间通过合适的Linker连接。PROTAC降解靶蛋白是通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）实现的，其大致过程如下，PROTAC分子结合靶蛋白（POI）和E3连接酶，形成三元复合物，给靶蛋白打上泛素化标签，泛素化的蛋白被细胞内的蛋白酶体识别并降解。
蛋白质作为病毒结构组成和正常生命活动所必需的共性生命物质，为人们操控病毒进而利用病毒提供了重要切入点。在本研究中，司龙龙团队将宿主细胞蛋白质降解机器可选择性降解靶蛋白的生物学机制，成功拓展至生命体-病毒疫苗的设计构建（图1）。该团队利用宿主细胞中天然存在的蛋白质降解系统，设计操控病毒蛋白质稳定与降解的元件，使得相应的病毒蛋白在正常细胞中被泛素-蛋白酶体系统识别而降解，导致病毒复制能力减弱，而成为潜在的疫苗；而在疫苗制备细胞中，连接病毒蛋白降解诱导元件的Linker会被酶切断而导致其移除，使得病毒蛋白得以保留，因此 PROTAC 病毒在疫苗制备细胞中可以高效复制而大量制备。
结果与讨论：
1，PROTAC流感病毒疫苗的构建
图1：PROTAC病毒生产系统的构建。VP, 病毒蛋白 (viral protein)；Ub, 泛素（ubiquitin）；PTD, 蛋白降解靶向元件（proteolysis-targeting domain）。
作者团队通过将一个蛋白酶体靶向结构域（PTD）与流感病毒蛋白（VP）融合，设计了PROTAC病毒（图1a，b）。PTD被设计为包含一段蛋白酶体靶向肽ALAPYIP，以及一个烟草蚀刻病毒裂解位点（TEVcs）Linker ENLYFQG，PTD可被von Hippel-Lindau tumor suppressor protein（VHL）识别，VHL是E3泛素连接酶的识别底物，可形成E3泛素连接酶复合物，给蛋白标记上多泛素标签，从而被蛋白酶体降解。因此，利用PTD选择性地诱导目标病毒蛋白的蛋白酶体降解。同时，TEVcs Linker可以被烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEVp）选择性裂解，从PTD中分离出病毒蛋白，使其免于降解。
为实现这一设计，作者团队用病毒载体构建可以表达TEVp酶基因的293T和MDCK.2稳转细胞株，用以维持疫苗生产过程中PROTAC 病毒的繁殖潜力。并通过qpcr和western blot的方式验证基因的表达（图1c）。通过接种A型/WSN/33(H1N1)流感病毒，检测了稳定细胞系传播野生型病毒的能力。噬斑实验表明，每个稳转细胞株与其相应的亲本细胞系之间的病毒繁殖效率相等（图1d）。接下来，选择了8个病毒蛋白（M1、PB2、PB1、PA、NP、M2、NEP和NS1）和PTD连接，在设计好的制备细胞体系中生成PROTAC病毒。在MDCK-TEVp细胞中繁殖出PROTAC病毒，并通过病毒感染引起的细胞病变效应（CPEs）验证其产生和传染性（图1e），发现M1-PTD在MDCK-TEVp细胞中引起明显的CPE（图1f），表明TEVp依赖的PROTAC疫苗M1-PTD的成功生成。
2，PROTAC流感病毒疫苗的安全性评价
在96h监测病毒生长，考察病毒生长曲线，发现M1-PTD 只能在 PROTAC 病毒制备细胞中高效复制而得以制备，而在正常细胞中复制能力显著下降而安全（图2a）；噬斑实验结果表明，M1-PTD 仅在 PROTAC 病毒制备细胞中可以形成噬斑，而在正常细胞中不形成噬斑（图2b）；免疫荧光实验结果表明，M1-PTD 病毒蛋白在正常细胞中被降解，在制备细胞中观察到了病毒的M1蛋白和核蛋白表达（图2c、d）。以上实验均表明PROTAC病毒具备成为安全疫苗的潜力。
图2：PROTAC病毒M1-PTD的表征。
3、验证PROTAC病毒疫苗的工作机理
接下来，作者团队对构建的 PROTAC 流感病毒的工作机理进行了验证。M1-PTD的蛋白在正常细胞中被降解而复制减弱，加入蛋白酶体抑制剂MG-132，发现能够浓度依赖性恢复M1-PTD的病毒蛋白表达水平和复制能力（图2e、f、g）。此外，加入VH298，抑制VHL-E3泛素连接酶复合物的形成，发现可降低M1-PTD病毒感染的MDCK细胞中病毒M1蛋白的降解。以上实验结果均说明PROTAC流感病毒的蛋白降解和复制减弱依赖于泛素-蛋白酶体降解途径。
4、使用动物模型对PROTAC病毒疫苗进行安全性评估
图3：PROTAC病毒M1-PTD在小鼠和雪貂体内的安全性评估。
作者团队使用小鼠模型对构建成功的 M1-PTD 流感病毒进行了安全性评价。将 M1-PTD 病毒或野生型流感病毒以滴鼻的方式接种于小鼠，监测小鼠的死亡率和体重，并检测其鼻洗液、气管、肺中的病毒滴度。结果显示（图3），与野生型病毒相比，M1-PTD 在动物体内的复制能力降低，体内病毒滴度显著小于接种野生型病毒的小鼠，且不会引起小鼠死亡或体重下降；在雪貂模型研究中，用同样的方法证实M1-PTD的安全性，观测到了和小鼠同样的结果。来自动物模型的数据说明：病毒通过宿主细胞蛋白降解机制在体内大大减弱，证明了在动物体内具备安全性。
4、使用动物模型对M1-PTD流感疫苗进行免疫效果评估
接下来，作者团队测试了M1-PTD在小鼠和雪貂中诱导免疫反应的能力。在小鼠模型研究中，通过血凝素抑制（HI）试验、中和（NT）抗体试验和ELISA试验测定，M1-PTD在接种后3周血清中诱导出现了抗体反应，M1-PTD诱导产生的HI抗体、中和抗体、抗病毒HA蛋白和核蛋白的IgG抗体高于广泛使用的灭活流感疫苗IIV以及减毒疫苗CAIV（图4a、b）。此外，相对于IIV疫苗，M1-PTD和CAIV对流感病毒的分泌性免疫球蛋白A（IgA）抗体诱导了高水平的黏膜免疫应答（图4c）。除了体液和黏膜反应外，通过流式细胞术和酶联免疫斑点（ELISpot）检测，M1-PTD诱导了小鼠肺中对病毒NP和M1抗原的强大T细胞反应（图4d）。
在雪貂模型研究中，M1-PTD也比接种3周后IIV诱导的HI抗体、NT抗体和IgA抗体更强（图4f、g）。从动物模型中得到的结果表明，PROTAC病毒疫苗诱导了广泛且强大的免疫力，包括体液、黏膜和细胞反应。
图4：PROTAC病毒M1-PTD在小鼠和雪貂模型中的免疫原性评估。
5、PROTAC疫苗对同源和异源病毒的攻击提供了保护
接下来，我作者团队评估了M1-PTD对小鼠和雪貂的同源和异源病毒攻击的保护作用。在小鼠模型研究中，用M1-PTD、IIV或CAIV免疫的小鼠在接种3周后用同源野生型病毒进行攻击，分析攻击后肺部的病毒滴度。虽然在模拟接种小鼠中检测到高病毒滴度，但在剂量接种M1-PTD后，肺部没有检测到病毒滴度，PROTAC疫苗对小鼠实现了完全保护作用（图5a）。就小鼠的生存率和体重而言，相比对照组，PROTAC疫苗也实现了最好的保护（图5b）。同样，在雪貂模型中，也观察到PROTAC疫苗很强的保护作用（图5c）。
为了检测M1-PTD疫苗接种对异源毒株的保护作用，用 M1-PTD免疫的雪貂接种A/Netherlands/602/2009 (pdmH1N1)病毒，攻毒后3天的病毒滴度测定表明，M1-PTD疫苗接种可降低雪貂鼻液和肺中的病毒滴度，表明M1-PTD疫苗接种提供了很强的异源保护作用(图5d)。
接种野生型同源病毒和异源病毒，检测小鼠鼻洗液和肺中病毒滴度，都发现了PROTAC疫苗很好的保护效应。这种保护是由于PROTAC病毒疫苗对病毒表面和内部蛋白产生广泛的体液、黏膜和细胞细胞免疫应答，可证明其有良好的交叉免疫应答。
图5：M1-PTD对小鼠和雪貂模型保护作用的表征。
总结：
本文基于合成生物学的理念，将细胞的蛋白质降解生物学机制PROTAC技术拓展至生命体-病毒疫苗的设计，PROTAC病毒在体内被充分减毒，但仍可以引起强大和多样的体液、黏膜和细胞免疫，从而可同时抵御同源和异源病毒的攻击。不仅为病毒疫苗开发提供了新思路，丰富了人类抵御病毒的疫苗技术武器库，也有助于促进细胞蛋白质降解机器基础生物学研究与疫苗研发医学转化的深度交叉融合。同时该团队指出，虽然该研究在细胞和动物模型中证明了 PROTAC 病毒疫苗概念的可行性，但 PROTAC 病毒作为疫苗的潜在应用仍需要大量的优化和探索。
