NAT CHEM丨无膜细胞器多相凝聚层模型中的相特异性 RNA 聚集和双链热力学

大家好，今天分享的文献是2022年6月发表在nature chemistry上的“无膜细胞器多相凝聚层模型中的相特异性 RNA 聚集和双链热力学”。

有关作者：

本文作者是宾夕法尼亚州立大学化学系的Christine D. Keating教授，主要研究方向为自组装人工细胞/拟细胞化学，重点是亚细胞微区室化的实验模型系统（聚合物水溶液的相分离模拟活细胞内部空间的区室化），以及益生元的区室化，研究重点是相分离系统的分子组成和物理化学性质，以及它们对聚集的分子（如 RNA）的影响。本文是作者与研究Bevilacqua 实验室合作的工作。

研究背景：

• ‘Coacervate’ 与液液相分离（LLPS） 

液液相分离形成的凝聚层是研究活细胞中无膜细胞器的重要模型。LLPS的发生，高度依赖溶液中生物大分子（比如：蛋白，DNA以及RNA等）的浓度、物理化学性质，以及溶液所处的环境，比如：温度、pH、盐离子浓度、盐离子类型以及溶液中存在其它的生物大分子。当浓度与当溶液中所处的大分子浓度低于一个特定的值c时，这一体系无论在什么样的温度，pH等条件下都不能发生相分离。当高于这一浓度后，在合适的pH以及温度等条件下，就能形成相分离现象，形成相分离后，该生物大分子便有两种存在形式，一种是在溶液中的低浓度状态，一种是形成的“液滴”中较高浓度的形式存在。随着相关条件的变化，两种形式可以相互转化。也就是说，相分离是一种高度动态的过程。

LLPS的广泛生物学功能还处于研究中，例如感知外部环境，进行响应（尤其是对于物理环境变化），调节大分子浓度以及形成孔状结构等。RNA作为无膜细胞器的重要组成部分，不同凝聚层的划分对于RNA的分布，结构以及生物活性有重要的作用。在以蛋白质为基础的凝聚液滴中，核酸依据自身的长度和互补情况发生不同的“区分”。例如DNA双链的解离相比于外部稀释的相更倾向于发生在凝聚的液滴里。体外实验证实，RNA结合蛋白（RBPs）能后使得RNA有更少的结构和缠绕，敲除RBP使得双链RNA 的含量增加。作者希望探究细胞利用液液相分离来组织RNA的生物化学机制。

• 相分离的表征

体外的相分离现象可以非常简单的使用普通的光学显微镜观察，发生相分离的特点是溶液会从澄清变得浑浊，镜检时会看到在溶液中会存在一些如水中的油滴状态的液滴。同时，还可以通过对其物理性质的表征如粘度、表现张力等，也可以通过荧光漂白恢复实验（FRAP）来测量液滴的流动性，以及液滴融合实验，FRET等来进行验证。

许多无膜细胞器的不同区室有不同的相发挥与之相关的特定功能。在某个特定的相有其固定的蛋白组成并且分布着不同种类的RNA。例如在核仁的多相隔室中，新生的pre-rRNA分布在纤维富集的内部成熟和进行修饰，在核磷蛋白NPM1丰富的外层与核糖核蛋白形成复合物。在这两层中，内层纤维蛋白FBL中精氨酸富集的序列与pre-rRNA相互作用，促进其在内层的积累；NPM1中酸性和中性的氨基酸序列也有RNA-binding domain（优先结合G4结构域）。在这个情景中，可以理解为多相的（无膜）细胞器中，不同的相通过利用RNA长度和结构依赖性的与蛋白质组分差异，来控制RNA分布并在空间上组织生化功能。

在目前报道的多层的凝聚相系统中，分子密度大形成的密集相能够更好地参与碱基配对或阳离子-π相互作用，更有效地积累简单寡RNA均聚物（15 mers尿苷酸或腺苷酸）。然而，目前尚不清楚这些观察到的普遍性现象是如何跨越其他链或序列的RNA，以及在多相凝聚层控制封装RNA空间分布是如何影响其功能的，例如它们的解离热力学（如何在相之间解离和跨越）。

整体设计：

在本篇文章中，作者设计了三种oligopeptide组合成的多相凝聚物，通过不同的RNA-Pepide 相互作用来影响RNA化学性质。相邻的相之间有着相当不同的oligopeptide区分，内层倾向于富集ssRNA,外层富集dsRNA，并且内层解旋活性较高。相比于单相的凝聚物，能够观察出更大的差异。这项工作表明，多相复合液滴中的不同相不仅根据其杂交状态以不同的方式招募RNA，但也通过利用多相系统中的耦合分配和解离平衡的机制来改变RNA杂交水平。（招募是通过RNA状态分配和鉴别的，在不同相中RNA的热力学性质反过来影响其杂交情况）

结果与讨论：

oligopeptide 形成多相液滴：

在细胞中形成相分离的蛋白质大多数都有重复序列，比如精氨酸（R10），赖氨酸（K10）和天冬氨酸（D10），作者选用了他们的十肽重复序列作为导致凝集作用的最小模型。它们的带电侧链提供离子对相互作用，驱动带正电的R10或K10与带负电的D10之间的凝集。其中R10由于其正电性更强，更倾向于阳离子-π和与碱基的π-π相互作用，作用力更强。

R10/K10/D10 液滴是多相的，每个液滴的内部凝聚相完全被外部凝聚相包围。通过罗丹明标记肽段的标曲对于每个相中的多肽浓度进行定量，多相凝聚层的两相并不是阳离子/阴离子对形成的相的简单共存。作者发现 R10/K10/D10 的内部凝聚相比外部凝聚相具有更高浓度的多肽，内层浓度约为1.5M，而外层仅有100mM。

构成多相 R10/K10/D10 凝聚层的融合实验显示了外部凝聚层相的快速融合，然后是内部凝聚层相的较慢融合。表明外凝聚相的粘度较低，对应其较低的肽浓度，并且粘度较低。光漂白（FRAP）实验后的荧光恢复证实了这一点。增加盐浓度会导致外凝聚层相的损失，也对应了多相凝聚物的肽浓度差异。

2，在单相和多相肽凝聚层中的RNA分配

作者测试了10 mer和 20 mer序列的单链和双链RNA，选择的序列在避免自身互补形成不必要的二级结构，并在杂交成双链时具有相同的 GC 含量。（并且满足其稳定程度随着双链浓度和盐离子浓度的增加而增加）

ssRNA 优先在 R10/K10/D10 液滴的内凝聚层中积累，10和20mer ssRNA 的局部浓度比这些液滴的外凝聚层高约10倍和约20倍。D10的阴离子侧链大多数处于R10/K10/D10 的内部凝聚层中，因为其带正电与 RNA 竞争结合R和K侧链，但 ssRNA 可以通过这些的组合与阳离子肽产生更强的相互作用。与 ssRNA 相比，dsRNA 在 R10/K10/D10 的外部凝聚相中优先（~1.6×）积累。

与内层相相比，外层R10/K10/D10 凝聚相由于其较低的肽浓度，可能具有更开放、动态的网状结构。此外，外凝聚相的阳离子侧链比阴离子侧链多约 2.6 倍，这可以使具有比 ssRNA更高电荷密度的 dsRNA在外部积累。

3，相特异性的RNA双链解离平衡

作者通过 FRET来确定每个像的 dsRNA 杂交情况。在这些实验中， 3'-Cy3 标记的 RNA 与其在双链体同一端具有 5'-Cy5 标记的反义序列预杂交。首先考虑单凝聚层系统 K10/D10 和 R10/D10。以缓冲buffer中的FRET效率作为对照， ssRNA 的接近零，到 10 mer和 20 mer双链效率约为0.7和0.8。在 K10/D10凝聚层中，RNA 10 mer杂交的 FRET 效率与其在缓冲液中的值相似，而 20mer RNA的FRET效率降低了约 20%，表明有部分双链的解离。

在多相 R10/K10/D10 凝聚层系统中，外层两种 RNA 长度的 FRET 效率都相对较高（RNA 10-mer 和 20-mer 分别为 ~0.7 和 ~0.8），类似buffer中的FRET值同时印证里外层较稀的肽浓度。

4，使用 FRET 数据来估计预杂交 dsRNA 分配实验的每个相中 ssRNA 和 dsRNA 的局部浓度

作者通过FRET的效率对于不同相中dsRNA 的浓度进行估计，ssRNA的计算公式如上图所示。同时定义了ssRNA与dsRNA 在不同相中的解旋平衡常数与不同相之间的分配平衡常数，将估算出的浓度对平衡常数进行推算，最后通过△G= -RTlnK计算自由能。

4，多相液滴中分配和解离平衡共同决定了ssRNA和dsRNA的分布。

单链 RNA 在内部凝聚层中积累 (Δ G _{P, ss}< 0)，并且 dsRNA 优先在外凝聚层中积累 (Δ G P, ds  > 0)。与 ssRNA 20-mer 相比，较短的 ssRNA 10-mer 聚集浓度更高。解离自由能始终为正（ΔG _D，i  > 0 和Δ G _D，o  > 0），反映了互补 RNA 更加倾向于形成双链，与FRET数据对应。作者还观测到到各相之间解离自由能的差异，dsRNA 在多相液滴的外凝聚相中更多，单链在inner 更稳定。

总结：

1，这项工作说明了，多相系统不仅仅是其组分相的总和，它们的共存引入了新的分配平衡，导致RNA在不同杂交状态下的分布有其偏好性。

2，即使在没有特异性结合基序或全长蛋白质的情况下，双链在多相无膜不同层中有不同的热力学倾向性。