JACS丨适体诱导二聚化策略通过调节 PrP信号的营养活性减弱 AβO 毒性

大家好，今天给大家分享的文献是福州大学杨黄浩课题组今年5月发表在JACS上的工作，题目是《适体诱导二聚化策略通过调节 PrP信号的营养活性减弱 AβO 毒性》。阿尔茨海默症 (AD) 是一种以认知和记忆功能下降为特征的慢性神经退行性疾病，给全世界的家庭和社会带来了沉重的负担。更糟糕的是，目前可用的药物无法治愈 AD，只能提供短期早期缓解。因此，迫切需要寻找有效的AD治疗方法。 AD 的主要组织病理学特征是大脑中聚集的β淀粉样蛋白 (Aβ) 的沉积。 最近的研究表明，Aβ 的危险形式是可溶性 Aβ 寡聚体 (AβO)，而不是成熟的纤维状 Aβ。

最近的研究表明，细胞表面的几种高亲和力受体负责 AβO 的募集和随后的神经毒性，包括细胞朊病毒蛋白 (PrPC)、N-甲基-D-天冬氨酸受体、EphB2 和乙酰胆碱受体。这些发现激发了人们对阐明 Aβ 受体识别的分子机制的兴趣，希望能开发出新的、有效的 AD 疗法来阻断 Aβ 与细胞受体的相互作用。值得注意的是，抗体与特定 PrP^C 表位的结合会对神经元功能产生有害影响，从而阻碍了抗-PrPC 抗体的临床应用。除了作为 AβO 结合受体外，PrP^C 还是一种神经保护和神经营养蛋白，其营养信号激活需要 PrP^C 二聚化。考虑到这一点，作者尝试调节 PrP^C 二聚化并探索 AD 的替代治疗干预治疗。

在这里，作者提出了一种适体诱导的二聚化 (AID) 策略，通过强制受体二聚化来调节 PrP^C 神经营养活性（Scheme1）。基于 DNA 的调节策略因其低成本、结构可编程性、高稳定性和易于修饰而被广泛应用于调节受体功能。然而，基于 DNA 的 AD 治疗药物的开发仍然是空白。在这种情况下，一个名为 4C5 的针对 PrP^C 的 DNA 适体被用作靶部分，因为它在 PrP^C 上的结合位点与 PrPC 上 AβO 的相互作用表位部分重叠。接着作者设计了一种名为 DBL-4C5 的 PrP^C 靶向 AID 配体以识别并与细胞表面的两个分离的 PrP^C 结合，诱导 PrP^C 二聚化并激活营养信号。 AID 策略被证明能够以多方面的作用减弱 AβO 的毒性作用：它可以（i）有效地阻断 PrPC-AβO 相互作用，同时促进神经保护片段的产生； (ii) 防止 AβO 诱导的线粒体功能障碍和 caspase-3 诱导的细胞凋亡； (iii) 减少炎性细胞因子的分泌，缓解神经炎症微环境。

Scheme：调节营养 PrP^C 信号和减弱 AβO 毒性的 AID 策略示意图

首先，为了确定 4C5 结合位点是否与 PrP^C 上 AβO 的相互作用表位重叠，作者使用 DNA 三级结构建模和蛋白质分别预测了PrP^C上 4C5（图 1a）和 AβO（图 1b）的结合位点/DNA 对接技术。氢键相互作用和盐桥主要推动了 4C5 与PrP^C的结合。例如，核苷酸 T52、T46 和 T39 与 R147、K193 和 K219 形成三个盐桥； 4C5（C40、C43、T47、C50、T51、T83）的核苷酸与PrP^C残基（S131、Y161/Q185、K193、Y154、N152/R147）之间形成六个氢键。其中，PrP^C的 K219、Y154 和 R147 残基也参与了 AβO 的结合。此外，计算机计算表明，4C5 直接与位于同一界面的 PrPC 残基接触以进行 AβO 结合（图 1c）。此外，4C5 在 PrP^C 上的结合位点与抗 PrPC 抗体的结合位点几乎没有重叠，这可能会产生副作用。这些结果表明 4C5 适体可能部分占据 AβO 的结合位点，从而干扰 AβO 与 PrPC 的结合。

图 1. 通过计算机方法预测的与 4C5 适体或 AβO 结合的 PrPC 结构模型。

接着作者通过在4C5适体末端延伸出粘性末端的方式构建了双4C5适体，即DBL-4C5。

PAGE电泳分析DBL-4C5的构建

作者接下来测试是否可以使用 DBL-4C5 来诱导 PrP^C 二聚化。绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的 PrP^C 在 PrP^C 缺陷型 HeLa 细胞中瞬时表达。然后，对经过或不经过 DBL-4C5 处理的 HeLa 细胞中的 PrPC-GFP 进行成像，并使用全内反射荧光显微镜分析荧光强度分布。如图 2a、b 所示，强度分布的直方图符合两个高斯分布的总和，代表单体和二聚体。在 DBL-4C5 处理后，二聚体数量从 19% 增加到 35%，而单体数量从 81% 下降到 65%。为了进一步确认 PrP^C 的单分子状态，作者计算了单个荧光 PrP^C-GFP 的光漂白步骤。通过分析光漂白痕迹，作者发现大多数 PrP^C-GFP 被视为天然细胞中的单体，只有 30% 的 PrP^C-GFP 处于二聚状态（来自 10 个固定细胞的 347 个点中的 106 个）。一步漂白的这种优势与 PrP^C 是单体而不是二聚体的预期一致。相比之下，在用 DBL-4C5 处理后，24.6%（308 个斑点中的 89 个）一步漂白，75.4%（308 个斑点中的 219 个）分两步漂白（图 S8b，c）。此外，PrP^C的二聚化能够激活各种细胞内信号通路，包括细胞外调节蛋白激酶 (ERK) 级联反应。因此，我们评估了 ERK (pERK) 的磷酸化，以评估 DBL-4C5 诱导的 PrP^C 后的下游激活二聚化。正如预期的那样，DBL-4C5 处理导致 pERK 显着增加（2.5 倍），而 4C5 处理没有激活 ERK 信号传导（图 2c）。

图 2. DBL-4C5 诱导 PrP^C 二聚化并激活下游信号。

如前所述，PrP^C二聚化产生神经保护性脱落 PrP^C (sPrPC)，它与神经毒性 AβO 结合，从而减少 AβO 与细胞之间的直接相互作用。为了验证这一推测，我们收集了 DBL-4C5 的上清液-处理的BV2细胞并检测sPrPC分泌。图 3a 显示，用 DBL-4C5 而不是 4C5 处理使 sPrPC 分泌显着增加了天然细胞的约 5 倍。这一结果表明，AID 可能不仅仅是阻断受体以抑制 PrP^C信号传导。然后作者检查了 DBL-4C5 对 BV2 细胞和 AβO 之间相互作用的抑制作用。正如所料，在存在 DBL-4C5 的情况下，与天然 BV2 细胞相比，细胞结合的 FITC 标记的 AβO 的量显着降低（77%）（图 3b，c）。这些结果表明DBL-4C5可以促进PrP^C的脱落并抑制AβO与细胞之间的直接相互作用。因此，AID 策略有望用于减轻 AβO 的神经毒性。

图 3. 促进 PrP^C 的脱落会降低 BV2 细胞中的 AβO 结合。

在 AβO 表现出的多方面毒性的各种途径中，线粒体功能障碍是突出的。线粒体功能障碍期间的主要变化是线粒体膜电位 (MMP) 降低和产生活性氧 (ROS)。为了评估 DBL-4C5 对挽救 AβO 介导的线粒体损伤的影响，作者在将荧光指示剂 JC-10.43 AβO 处理的 BV2 细胞与 DBL-4C5、4C5 或随机 DNA 独立孵育 12 小时，然后进行 JC-10 染色和 CLSM 成像。如图 4所示，在 AβO 暴露后，可以在 BV2 细胞中观察到 MMP 的显着降低，如 JC-10 的聚集体/单体比率的降低所示。然而，与用 4C5 或随机 DNA 处理的细胞相比，用 DBL-4C5 预处理显示 MMP 显着增加。因此，可以合理地得出结论，DBL-4C5 诱导的 PrP^C 二聚化可防止 AβO 介导的线粒体功能障碍。

图 4. 不同条件下 BV2 细胞中 JC-10 染色的 CLSM 图像。

线粒体损伤可能导致细胞凋亡的激活，以应对不可逆的细胞损伤。鉴于 AID 策略成功挽救了 AβO 引发的线粒体损伤，作者旨在研究 DBL-4C5 是否可以抑制细胞凋亡。为此，通过蛋白质印迹测定检查caspase-3的活化。将BV2细胞暴露于AβO导致裂解的caspase-3（天然细胞的约20倍）的上调，这是细胞凋亡的标志物，如裂解的caspase-3的蛋白质印迹所示（图5a）。值得注意的是，DBL-4C5 将 caspase-3 的活化显着降低了 52%。然而，4C5 处理并没有抑制 caspase-3 的激活。鉴于 AID 策略有效地阻断了 AβO 对线粒体功能的损害，作者随后检查了其减弱 AβO 细胞毒性的能力。为此，进行 CCK-8 测定以确定 BV2 细胞与具有不同 DNA 配体的 AβO 共孵育后的细胞活力（图 5b）。 AβO 以剂量依赖性方式显示出细胞毒性，与未处理的细胞相比，5 μM AβO 处理的细胞显示出约 50% 的细胞活力。值得注意的是，与单独用 AβO 处理的细胞相比，具有 AβO 毒性的 DBL-4C5 处理的细胞的活力提高了 30%。

图 5. DBL-4C5 阻断 AβO 诱导的细胞凋亡和细胞毒性。

综上所述，作者提出了一种通过调控PrP^C受体二聚减少可溶性 Aβ 寡聚体对神经细胞损伤的新型阿尔兹海默症的治疗策略。