JACS | 基于亲和力对黄素单核苷酸核糖开关的分析
今天分享的是近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的一篇文章，标题为Affinity-Based Profiling of the Flavin Mononucleotide Riboswitch。
有关作者：
本文的通讯作者为荷兰Radboud University Nijmegen的Willem A. Velema，该课题组的主要研究方向包括核酸化学、化学生物学及细菌抗药性。
研究背景：
核糖开关（riboswitch）是mRNA 5′-未转译区的顺式调控元件，其控制基因表达，并且广泛存在于细菌中。核糖开关包括适配体和表达调节两部分序列，前者与配体的结合能引发后者的构象变化，进而调节下游基因的表达。
长久以来，针对核糖开关的机理研究多采用物理方法，例如核磁共振波谱实验、X射线晶体衍射、荧光光谱等，且研究的样本为合成的RNA；对核糖开关结构性质的研究仍是一大挑战。
作者拟通过化学方法将核糖开关与其配体共价连接（图1A），以进一步研究其结构与成药性。本文的研究对象为黄素单核苷酸（flavin mononucleotide, FMN，图1B）核糖开关。作者开发了光亲和探针以探究纯化RNA、细菌提取物及活细菌中FMN核糖开关与其配体的相互作用。
图1. （A）光亲和探针的工作原理；（B）FMN的结构；（C）本文设计的探针结构。
结果与讨论：
基于FMN的结构与性质，作者设计了图1C中三种探针。其中，异咯嗪（橙色）用于结合FMN核糖开关，随后光活性基团（蓝色）与该核糖开关共价连接，炔基（绿色）作为ligation handle便于后续分析。
图2. （A）1、2、3号探针对FMN核糖开关的结合效率；（B-C）1号探针对FMN核糖开关的选择性。
作者首先将Cy5荧光团通过叠氮-炔基反应连接在探针上，并测试了1、2、3号探针在体外对FMN核糖开关的结合效率。由图2A所示，1号探针对FMN核糖开关的结合效率最高，因此后续实验均采用1号探针进行。作者进一步探究了1号探针对FMN核糖开关的选择性（图2B-C）。仅当UV照射和荧光团连接同时存在时，该核糖开关才能被1号探针标记。当FMN加入竞争实验，1号探针对FMN核糖开关的标记信号消失。此外，1号探针无法对腺嘌呤核糖开关进行标记。
在验证结合效率与选择性之后，作者通过SHAPE探究了1号探针与FMN核糖开关的结合机理（图3）。他们将FMN核糖开关与1号探针、FMN分别孵育后，得到的切割产物条带相似，表明1号探针通过与FMN类似的方式结合FMN核糖开关。
图3. SHAPE实验探究1号探针与FMN核糖开关的结合机理。
在确认结合方式后，作者设想光亲和标记的策略可用于研究其他小分子与核糖开关的相互作用。他们对1号探针开展了与FMN和roseoflavin的竞争性实验（图4），测得FMN和roseoflavin对1号探针的IC50分别为0.4 ± 0.01 和 7.0 ± 0.18 μM，二者之间20倍的差异与FMN和roseoflavin对FMN核糖开关的Kd差异相符。因此，1号探针可用于对FMN核糖开关配体分子的筛选。
图4. FMN和roseoflavin对1号探针竞争性的光亲和标记实验。
核糖开关的折叠取决于温度与阳离子浓度。当温度升高或阳离子浓度降低，核糖开关逐渐展开，其与配体分子的相互作用也减弱。基于其工作原理（图1），1号探针仅对折叠状态的FMN核糖开关有响应，作者拟利用该性质探究FMN核糖开关的折叠状态。他们采集了1号探针与FMN核糖开关在不同温度和阳离子浓度下相互作用的荧光信号（图5），发现荧光-温度曲线或荧光-阳离子浓度曲线的中点与文献报道的折叠数据相符，证明该类光亲和探针可用于研究核糖开关在不同条件下的折叠状态。
图5. 利用1号探针探测FMN核糖开关的折叠状态。
图6. 逆转录实验探究1号探针与FMN核糖开关的结合位点。
作者进一步研究了1号探针与FMN核糖开关在单核苷酸分辨率下的结合位点（图6）。在光交联之后，1号探针与FMN核糖开关之间共价键的形成将终止逆转录，得到的产物通过凝胶电泳分析后，可推断共价键形成的位点。在37 °C，1号探针与FMN核糖开关共孵育后，逆转录终止的位点为G35-C37, A91, G154和G156（图6B），表明上述核苷酸与1号探针相邻而形成共价键；分子对接实验也支持了上述结论（图6C）。作者在51 °C重复了上述实验，发现在A143和A152处形成了新的逆转录终止位点，该现象可能源自升温后FMN核糖开关的局部结构变化。
最后，作者将1号探针用于细菌提取物和活大肠杆菌内FMN核糖开关的标记（图7-8）。在细菌提取物中，1号探针可实现对FMN核糖开关的富集（图7A），且UV照射与flavin框架均为富集实现的必要条件（图7A-C）。当温度升高时，富集效率降低，这可能源自FMN核糖开关结构的展开（图7D）。在活大肠杆菌内，1号探针同样能实现FMN核糖开关的富集（图8），且富集效率随竞争物的加入而降低，与前文竞争性实验结果相符（图4）。
图7. 1号探针对细菌提取物中FMN核糖开关的标记。
图8. 1号探针对活大肠杆菌中FMN核糖开关的标记。
总结：
作者开发了研究核糖开关与小分子相互作用的光亲和探针，该探针可用于筛选核糖开关的配体，以及表征不同条件下核糖开关的折叠情况。该探针可用于细菌提取液与活大肠杆菌中核糖开关的富集，并有望拓展到更复杂的生物样品中。
S. Crielaard, R. Maassen, T. Vosman, I. Rempkens and W. A. Velema, J. Am. Chem. Soc., 2022, DOI: 10.1021/jacs.2c02685.
