NAT REV DRUG DISCOV丨用于传染病的mRNA疫苗的原理，递送和临床转化

大家好，今天分享的文献是2021年发表在Nature Reviews Drug Discovery上的“用于传染病的mRNA疫苗的原理，递送和临床转化”作者是来自卡内基梅隆大学化学工程系的 Whitehead教授，课题组的主要方向是RNA递送和基因工程，以及大分子的口服给药。

mRNA 疫苗是一种使用称为信使 RNA (mRNA)来产生抗原激发免疫反应的疫苗。疫苗将编码抗原的mRNA分子递送到免疫细胞中，免疫细胞使用设计的 mRNA 作为蓝图来构建通常由病原体（如病毒）或癌细胞产生的外源蛋白。这些蛋白质分子刺激适应性免疫反应，使得免疫系统识别和破坏相应的病原体或癌细胞。1990年，Wolff教授使用 mRNA 编码用于疫苗接种的蛋白质替代传统抗原的概念首次在体内实验得到验证。证明了在小鼠肌肉内 (im) 注射后靶蛋白的产生，此后虽然mRNA疫苗仍然在发展中，但是传统的灭活疫苗占据着较大的市场。

mRNA 疫苗作为COVID-19 疫苗引起了相当大的兴趣，并由此迎来了快速发展。以2020 年时间表为例，2020 年 12 月，辉瑞-BioNTech和Moderna获得了基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗的授权。12 月 2 日，英国药品和保健品监管机构(MHRA) 成为第一个 批准 mRNA 疫苗的药品监管机构，授权辉瑞-BioNTech 疫苗广泛使用。12月11日，美国食品药品监督管理局（FDA）发布紧急使用授权辉瑞-BioNTech 疫苗和一周后类似地授权了莫德纳疫苗，截止目前，mRNA疫苗的临床实验迎来了高峰期。本文以mRNA 编码设计——合成原理——包装递送——抗原提呈激活适应性免疫——针对传染性疾病的mRNA疫苗，为线梳理了mRNA疫苗目前的发展。

编码设计原理：

相比于传统的疫苗技术需要使用哺乳动物细胞或者鸡蛋翻译出目标的蛋白作为抗原，批量生产疫苗，mRNA 疫苗使用人体作为疫苗的“生产终端设备”，具有一些优势：

1，能够实现对蛋白质产品进行人类翻译后修饰 (PTM)，从而具有更低的免疫原性和完整的功能。2.可以产生一些在传统蛋白产生体系中不能生产的多聚体蛋白，并且正确翻译、折叠和组装。3. mRNA 疗法可以产生跨膜蛋白和细胞内蛋白，并将它们运输到细胞环境中的适当位点。

mRNA疫苗可以分为非自我复制的mRNA与自放大的mRNA疫苗两种。共同的是体外转录 (IVT) mRNA 都是模拟内源性 mRNA 的结构，有五个部分组成，从 5ʹ 到 3ʹ依次为：5ʹ cap、5ʹ非翻译区 (UTR)、编码抗原的开放阅读框ORF、3ʹ UTR 和 poly(A) 尾巴。

其中5ʹ Cap为 7-甲基鸟苷修饰，此外从 5‘ 末端开始的第一个或第二个核苷酸在核糖2‘- O-甲基化，阻止细胞质传感器对病毒 RNA的识别，以防止引起意外的免疫反应。poly(A) 尾：募集核糖体开始翻译，poly(A) 尾的长度间接调节 mRNA 翻译和半衰期。5ʹ 非翻译区(UTR)， 3ʹ UTR：调节 mRNA 翻译、半衰期和亚细胞定位，其二级结构可能对翻译有影响。编码抗原的开放阅读框ORF：合理优化密码子，进行核苷酸的修饰（以防被模式识别受体识别）。此外，因为未修饰的 mRNA 被模式识别受体例如 Toll 样受体 3 (TLR3)、TLR7 和 TLR8识别，TLR7 和 TLR8与 mRNA 中富含鸟苷或尿苷的区域结合，并触发 I 型干扰素的产生，例如 IFN-α，进而可以阻断 mRNA 翻译。因此，使用修饰的核苷，特别是修饰的尿苷，可防止模式识别受体的识别，从而实现足够水平的翻译以产生预防性数量的蛋白质。Moderna 和 Pfizer-BioNTech SARS-CoV-2 疫苗在 III 期临床试验中产生了 >94% 的功效，都含有核苷修饰的mRNA。

对于自我复制（扩增）mRNA疫苗：包含编码依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶的基因。这类病毒衍生的聚合酶可以在细胞内放大 mRNA 转录物，从而能够在 mRNA 剂量减少的情况下表达大量抗原。nsP1、2、3 和 4 分别编码负责 mRNA 加帽、NTPase/解旋酶/蛋白酶、主要结构域和 RDRP（RNA依赖的RNA聚合酶），nsP 系列的翻译导致前体多蛋白的产生，形成合成 RNA 负链的早​​期复制复合物。多蛋白的进一步切割产生晚期复制复合物，该复合物通过使用负链作为模板合成基因组和亚基因组 RNA 的正链。从而使得一个 saRNA 拷贝产生多个 RNA 转录物拷贝，克服了体内mRNA 治疗细胞溶质递送低的问题。saRNA 疫苗的缺点在于， saRNA 序列大而复杂，nsP1-4 序列的长度约为 7 kb，这通常使 saRNA 疫苗的全长超过 9 kb，使得mRNA疫苗更加复杂。

合成生产原理：

mRNA被合成生产并配制成疫苗的主要流程为：(1) 当病原体的基因组被测序后，目标抗原的序列被设计并插入到质粒 DNA 构建体中。(2) 质粒 DNA 在体外通过噬菌体聚合酶转录成 mRNA(3) mRNA 转录物通过高效液相色谱 (HPLC) 纯化以去除污染物和反应体系内的其他物质。(4) 纯化的 mRNA 在微流体混合器中与脂质混合，形成脂质纳米颗粒。快速混合导致脂质瞬间包裹 mRNA 并沉淀为自组装纳米颗粒。(5) 将纳米颗粒溶液透析或过滤以除去非水溶剂和任何未包封的mRNA，和(6) 将过滤后的mRNA疫苗溶液储存在无菌小瓶中。

在简化 mRNA 生产方面也取得了重大进展，例如使用噬菌体 RNA T7聚合酶从 DNA 质粒体外转录临床使用的合成 mRNA。它采用 2'- O-甲基化帽共转录加帽，poly (A) 尾编码在 DNA 模板中，克服了使用 poly(A) 聚合酶的酶促聚腺苷酸化引起的尾长变异性。大于 100 bp 的 Poly(A) 尾部是治疗性 mRNA 的最佳选择，但是编码这些长 poly(A) 片段的 DNA 序列可能会破坏用于转录的 DNA 质粒，目前的解决方案是在poly(A)尾中包括短的UGC接头。

组装过程：

内体逐渐演变为溶酶体过程中最突出的变化是pH的降低。出于这个原因，促进纳米载体内体逃逸的主要方法是使它们对内体的酸化产生响应。在诱导纳米载体内体逃逸有三类主要策略：（1）使内体膜不稳定，（2）“质子海绵”效应导致内体渗透性破裂，以及（3）内体破裂通过颗粒膨胀。一般而言，基于脂质的材料被认为具有更高的破坏膜稳定性的倾向，并且聚合物材料被认为通过渗透或肿胀介导的破裂来破坏内体。

在LNP组装过程中，四种脂质（可电离脂质、DSPC、胆固醇、PEG-脂质）溶于乙醇，mRNA保存在PH=4的水性醋酸溶液中。1 体积的含脂质乙醇溶液通常与 3 体积的 mRNA 在 pH = 4 的水性醋酸盐缓冲液中混合，这样当脂质接触水性缓冲液时，可电离的脂质质子化并带正电荷，然后驱动它与 mRNA 带负电荷的磷酸骨架静电结合，随着可电离脂质变为中性，溶解性逐渐降低，形成更大的疏水性脂质结构域，驱动 LNP 的融合过程，使其尺寸增加，LNP 的核心变为无定形的含有与 mRNA 结合的可电离脂质，最后融合形成一个最终的 LNP，将mRNA包裹在主要水性悬浮液中。

最早用于 RNA 递送的是阳离子脂质，最著名的是商品化的 Lipofectamine，但是在体内实验中，由于其有促凋亡和促炎反应，并不适用于mRNA疫苗的包装。

可电离脂质可以解决一定的安全性问题。可电离脂质与 mRNA 在酸性缓冲液中配制为纳米颗粒，使脂质带正电荷并吸引 RNA。此外，它们在内体的酸性环境中带正电荷，这促进了它们与内体膜的融合，将它们释放到细胞质中。首个被FDA批准的用于siRNA药物的LNP制剂中的可电离脂质部分为DLin-MC3-DMA。

可电离脂质可以说是 LNP 最重要的成分，但其​​他三种脂质成分——胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质，也促进纳米颗粒的形成和功能。胆固醇是一种天然存在的脂质，通过填充脂质之间的间隙来增强纳米颗粒的稳定性，并且它有助于在摄取到细胞中的过程中与内体膜融合。辅助脂质通过促进有助于膜与内体融合的脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并提高功效。DSPC 已被纳入 FDA 批准的 SARS-CoV-2 疫苗 mRNA-1273 和 BNT162b2。LNP 的聚乙二醇化脂质成分由与锚定脂质（如 DMPE 或 DMG）与缀合的聚乙二醇 (PEG) 组成。亲水性 PEG 稳定 LNP，通过限制脂质融合调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒半衰期。因为 PEG 链是亲水性的，因此覆盖了颗粒并决定了其最终的热力学稳定尺寸。通过改变 PEG 的摩尔分数，可以预测 LNP 的大小，例如，从 0.5% 摩尔分数的 100 nm 到 3% 摩尔分数 PEG-脂质的 43 nm（含量越多粒径越小）。

此外，还有通过聚合物和阳离子纳米乳液进行包装的方法，如图所示PEI、PBAE，PEG-PAsp(DET)和CART形成聚合物-mRNA复合物。阳离子纳米乳液包含由阳离子脂质（例如，DOTAP）和表面活性剂（例如 Tween 80 和 Span 85）制成的外壳包围的角鲨烯核心，mRNA 通过静电结合吸附到表面。还有一些使用穿膜肽对mRNA进行递送的方式。

抗原提呈激活适应性免疫

肌肉内注射 mRNA 疫苗的作用方式主要有：转染到注射部位附近非免疫细胞的体细胞如肌肉细胞和表皮细胞，产生抗原；转染注射部位的组织驻留的专职APCs，例如组织居留的DC细胞，巨噬细胞等；转染到在次级淋巴组织中的免疫细胞，包括淋巴结和脾脏中的免疫细胞。

mRNA 疫苗通过转染抗原呈递细胞引发适应性免疫的主要流程为，注射的mRNA疫苗被抗原呈递细胞内吞（转染），mRNA脱离内体进入胞质后，被核糖体翻译成蛋白质。翻译后的抗原蛋白可以通过多种方式刺激免疫系统。细胞内抗原被蛋白酶体复合物分解成更小的片段，这些片段被主要组织相容性复合物MHC I提呈至细胞表面给CTL（细胞毒性T）。（专职APC可能通过信号肽途径通过MHC II提呈给Th细胞）活化的CTL通过分泌溶细胞分子如穿孔素和颗粒酶来杀死被感染的细胞。此外，分泌的抗原可以被细胞摄取，在内体中降解，并通过 MHC II 类蛋白呈递到细胞表面给辅助 T 细胞。辅助性 T 细胞通过刺激 B 细胞产生中和抗体，并通过炎性细胞因子激活巨噬细胞等吞噬细胞，促进循环病原体的清除。

生物医学应用是在迅速发展中的，要提到的一点是，除了用于传染性疾病预防，mRNA疫苗也有用于癌症免疫治疗性，以及细胞免疫治疗等。

针对传染性疾病的mRNA疫苗：

能够进入细胞的表面蛋白通常被 mRNA 疫苗用于靶向病毒，例如严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的刺突蛋白、流感病毒的血凝素蛋白、寨卡病毒的包膜蛋白 (prM-E )、呼吸道合胞病毒 (RSV) 的融合蛋白和人类免疫缺陷病毒 (HIV)、埃博拉病毒和狂犬病病毒的表面糖蛋白。此外，可以使用非表面抗原（如疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子 (PMIF) 或恶性疟原虫）靶向复杂的病原体，如疟原虫富含谷氨酸的蛋白质（PfGARP）。

截止至文章发表的2021 年 6 月 18 日，185 种 COVID-19 候选疫苗处于临床前开发阶段，另有 102 种已进入临床试验，其中19 种是 mRNA 疫苗。2020 年 12 月 11 日，辉瑞-BioNTech 疫苗 BNT162b2 获得 FDA 的紧急授权，成为第一个批准用于人类的 mRNA 药物。一周后，Moderna 疫苗 mRNA-1273 也获准在美国使用。最终，它们是在美国、英国、加拿大和其他几个国家获得授权的第一批 SARS-CoV-2 疫苗。

辉瑞和 BioNTech 共同开发了五种 mRNA 候选疫苗，它们主要编码刺突蛋白抗原的变体。其中两个主要候选药物 BNT162b1 和 BNT162b2 使用 LNP进行包装和递送，这些 LNP 使用 Acuitas Therapeutics 的可电离脂质 ALC-0315 和核苷修饰的 mRNA，其中所有尿苷都被 N1-甲基假尿苷取代，以增强 mRNA 翻译。BNT162b1 编码刺突蛋白受体结合结构域的三聚体分泌版本，而 BNT162b2 编码全长 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白。两种候选疫苗都具有良好的耐受性和有效性，但只有 BNT162b2 疫苗由于其较温和的全身和局部不良反应而进入 II/III 期试验. 在涉及 43,548 名参与者的 III 期试验中，BNT162b2 在预防 COVID-19 方面的总体疗效为 95%，在由年龄、性别、种族、民族、基线体重指数和共存疾病定义的亚组中显示出 90-100% 的疗效。

Moderna 莫德纳与美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所和生物医学高级研究与发展局合作开发了 mRNA-1273。该疫苗使用可电离脂质 SM-102 来配制包裹 N1-甲基假尿苷修饰的 mRNA，该序列编码具有两个脯氨酸取代的 SARS-CoV-2 刺突蛋白。在涉及 30,420 名志愿者的 III 期试验中，两次 100 μg 疫苗剂量在预防 COVID-19 发作方面的有效率为 94.1%。注射部位的局部疼痛是最常见的副作用，在第二次给药后，一半的志愿者报告了中度至重度的全身副作用（例如，疲劳、肌肉疼痛、关节痛），这些副作用在 48 小时内消退。在涉及美国 3,950 名医护人员、急救人员和其他基本和一线工作人员的现实条件下，两剂 mRNA-1273 或 BNT162b2 对 SARS-CoV-2 的有效率为 90%

尽管辉瑞-BioNTech 和 Moderna 疫苗已显示出出色的疗效和安全性，但它们对冷链储存的需求带来了困难，mRNA-1273 可以在 4-8℃ 下储存一个月，在室温下可以储存 12 小时，而 BNT162b2 需要在 -60℃下储存。

热稳定候选疫苗 ARCoV 由中国人民解放军军事科学院与 Walvax Biotechnology 合作开发，可在 25℃下稳定一周。ARCoV 编码刺突蛋白的受体结合结构域。在临床前研究中，两次10μg剂量的小鼠和两次100μg 的食蟹猴剂量相隔 21天给药，可引发高 SARS-CoV-2 特异性 IgG 抗体和强病毒中和滴度。

mRNA疫苗目前存在的问题：

产生抗体的持续时间：如何进行更加有效的靶向递送给专职APC细胞，延长翻译出抗原的时间，在人体中产生抗体的持续时间。

针对新兴病毒变种的疫苗：是否能及时根据变异体进行有效安全的疫苗开发。

安全性问题：在临床试验中发生的轻度或中度不应事件，过敏反应。发展时间不足，需要更好地了解 mRNA 疫苗配方如何引起过敏反应，以便重新设计配方以提高安全性。

特定人群的疫苗接种：由于免疫系统的差异，特定人群可能会受益于替代疫苗接种策略或对疫苗接种的反应不同，尤其是老年人的适应性免疫能力减弱的情况下，如何适当放大免疫反应。

疫苗的保存：热稳定mRNA疫苗的开发，现有疫苗的严格储存要求。