NUCLEIC ACIDS RES丨CRISPR-Cas9-mediated nuclear transport and genomic integration of nanostructured genes in human primary cells

  大家好，今天分享的是2022年2月发表在《Nucleic Acids Research》上的一篇题为：CRISPR-Cas9-mediated nuclear transport and genomic integration of nanostructured genes in human primary cells的文献，该工作利用编码人类原始基因和荧光蛋白基因构成的DNA纳米结构作为模板，通过CRISPR介导的同源定向修复（HDR）实现了基因编辑。

关于作者：

  该文献的通讯作者为Jennifer A. Doudna教授，Jennifer教授1989年于美国哈佛医学院获得博士学位，现为美国加州大学伯克利分校教授及美国霍华德·休斯医学研究所研究员。Jennifer教授与Emmanuelle Charpentier因开发了一种基于CRISPR的基因组编辑方法获得了2020年诺贝尔奖。

  DNA纳米结构在细胞和体内的应用受到细胞对结构的摄取和结构的稳定性的限制，此外，尽管DNA纳米结构已经被证明能够有效递送小分子、肽和蛋白质、核酸等到细胞表面或细胞质，但将基因组信息传递到细胞核仍然是一个关键挑战。为此，CRISPR-Cas9介导的同源定向修复（HDR）结合DNA纳米结构（origami）提供了一种有吸引力的途径。将同源序列设计在DNA纳米结构中，可以通过同源DNA序列来靶向目标基因。此外，DNA纳米结构可以为用于基因组工程的改良HDR模板提供途径，例如，可以折叠长单链DNA（ssDNA）供体模板以实现带有同源性序列的末端和预期基因组插入位点（同源臂）共定位。

基于此，作者使用编码完整人类基因和一个荧光蛋白编码基因的DNA纳米结构作为模板，通过CRISPR介导的同源定向修复（HDR）进行基因整合。设计的DNA纳米结构上包括CRISPR-Cas9核糖核蛋白结合位点，以增加穿梭进入细胞核。作者分别使用转染和电穿孔证明了DNA纳米结构的有效穿梭和基因组整合。数据表明，与人类原代细胞中的非结构化双链DNA模板相比，纳米结构模板显示出更低的毒性和更高的插入效率。此外，作者证实病毒样颗粒是一种有效的DNA纳米结构递送方法，开启了将纳米结构递送至体内特定类型细胞的可能性。本研究提供了利用DNA纳米结构进行基因传递的新方法，利用DNA纳米结构设计特征和编码遗传信息的能力，开发了其作为HDR模板的应用。

用于人类基因组整合的编码mNeonGreen的DNA纳米结构设计

​​​​​​​  为了测试DNA纳米结构是否可以进入细胞核，以及折叠成紧凑的DNA结构是否影响模板用于基因整合的效果，作者设计了一个2716 bp的编码mNeonGreen的ssDNA支架，（图1A和B），在ssDNA两端分别有100 bp的同源臂，与预期的CRISPR-Cas9切割位点侧翼的序列相匹配，因此在成功HDR后，最终整合的新序列为2516 bp。除mNeonGreen外，插入片段还包括一个转录启动子、一个多聚腺苷酸化信号和一个土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。模板的成功整合会产生绿色荧光细胞（mNeonGreen+），从而能够检测到基因组整合。

​​​​​​​  按照DNA纳米结构设计规则，将模板设计为空心18螺旋束（命名为“18螺旋纳米结构”，图1C）。设计的18螺旋纳米结构的横截面不大于已知穿过核孔的蛋白质直径。同时，设计的结构折叠使得两端的同源臂更靠近，以验证这是否有利于DNA模板的基因组整合。此外，作者利用粗粒度模型oxDNA进行MD模拟来指导设计过程，评估折叠结构的能量学，并比较DNA模板末端之间的距离。与预期一致，oxDNA模拟预测与折叠纳米结构（29±10 nm）相比，非结构化ssDNA模板（109±11 nm）中的末端同源位点相距更远。AFM图中观察到的构象与非结构化模板和折叠纳米结构的模拟一致，18螺旋纳米结构显示出与设计特性一致的紧凑、均匀的形态（图1C和D）。

图1. 用于人类基因组整合的编码mNeonGreen的DNA 纳米结构

DNA纳米结构的核定位和基因组整合

​​​​​​​  为了测试18螺旋纳米结构是否可以在CRISPR-Cas9基因组切割后进入细胞核并整合到人类基因组中。使用HEK293T细胞采用了两种不同的DNA递送策略：（1）使用Lipofectamine转染0.5 pmol 18螺旋纳米结构以及编码CRISPR-Cas9和靶向9号染色体位点的sgRNA的质粒（图1B和2A）；（2）用CRISPR-Cas9 RNP和0.5 pmol的18螺旋纳米结构对HEK293T细胞进行了电穿孔。两种递送策略均以0.5 pmol非结构化ssDNA（命名为“非结构化”）以及0.5 pmol DNA“环状”结构（ssDNA末端通过几条链的碱基配对连接在一起，将模板折叠成闭合环，命名为“环状”）作为对照，用于代替18螺旋纳米结构作为HDR模板（图2A）。7天后（选择这个时间点是为了避免可能由DNA供体模板的瞬时表达引起的假阳性）收集细胞，并通过流式细胞仪分析mNeonGreen+细胞的百分比。结果表明，使用这两种递送方式，DNA纳米结构均能够进入细胞核并整合到基因组中。通过转染递送时，18螺旋纳米结构产生的HDR效率低于于非结构化DNA（图2B和C）。通过电穿孔递送时，18螺旋纳米结构模板与非结构化模板的HDR水平较为接近。有趣的是，与非结构化DNA相比，同源臂距离较近但模板本身是非结构化的环状纳米结构导致电穿孔样品中HDR效率的统计学显着增加（图2B和C）。使用Cas9切割位点两侧的引物，通过凝胶电泳实验证实了mNeonGreen构建体在预期位置的插入（图2D）。为了确定电穿孔是否影响DNA纳米结构的完整性，通过AFM表征证实了DNA纳米结构在电穿孔后保持完整性（图2E）。以上结果表明，DNA纳米结构可以通过电穿孔传递到细胞核中，并作为CRISPR-Cas9介导的HDR的模板。

图2 纳米结构DNA的核定位和基因组整合

在模板DNA末端通过CRISPR-Cas9 RNP定位提高HDR效率

​​​​​​​  接下来，作者研究了在DNA纳米结构中添加截短的Cas9靶序列，是否可以提高核定位和随后的基因组整合率（图3A）。作者分别使用1.0 pmol的非结构化、环状或18螺旋纳米结构进行实验，结果表明，模板DNA末端的Cas9 RNP提高了以上各个模板的HDR效率（图3B）。为了确定Cas9 RNP是否按预期直接与DNA纳米结构结合，将DNA与RNP一起孵育，并对样品进行AFM表征。AFM图像显示Cas9 RNPs绑定到18螺旋纳米结构的一侧，其中同源臂和穿梭序列明显位于该侧（图3C）。此外，为了探究这种策略是否可用于将纳米结构的DNA输送到不同类型的细胞中，利用人类永生化骨髓性白血病K562细胞进行电穿孔。结果显示所有模板在1.0 pmol浓度下的相似HDR效率（图3D）。这些结果表明，模板DNA末端的Cas9 RNP可以增加纳米结构DNA在不同细胞系中的基因组整合效率。

图3 模板DNA末端的CRISPR-Cas9 RNP定位提高HDR效率

与非结构化dsDNA相比，包含人类基因的纳米结构DNA可增强人类原代细胞HDR

​​​​​​​  接下来，作者将靶向IL2RA ∼3.5 kb多基因盒的纳米结构DNA递送到原代人类T细胞中实现HDR。ssDNA支架包括整个IL2RA开放阅读框，融合一个GFP编码序列和一个单独的mCherry编码序列，其两侧有两个∼300 bp的同源臂（图4A）。将此HDR模板插入基因组会导致由内源性IL2RA启动子驱动的IL2RA-GFP融合蛋白和由EF1a启动子驱动的单独mCherry蛋白的共表达。单独的GFP表达表示截断插入，单独的mCherry表达可以表示截断或插入到脱靶基因组基因座中。如图4B所示，作者以交替的碱基配对模式制备了四种不同版本的DNA纳米结构（50% Staples）、仅同源臂所在的上半部分受限的18-螺旋纳米结构（Only top）、开放片状结构（open）和完整的18-螺旋纳米结构（Complex），所有HDR模板都包含穿梭序列，并利用以上模板和Cas9 RNPs通过电穿孔递送至原代人类T细胞进行实验。结果显示，与长的非结构化ssDNA相比，所有DNA纳米结构都表现出相似的DNA插入效率，这与前面在HEK293T和K526细胞中的结果一致（图3和4C）。同时，ssDNA模板相对于dsDNA对照表现出更低的毒性和更高的HDR效率（图4C），此结果与之前的报道一致。虽然DNA纳米结构包含折叠的dsDNA片段，但它们造成的毒性比非结构化dsDNA模板低（图4D），可能的原因是DNA纳米结构的紧凑性，其中dsDNA螺旋紧密堆积在一起因而不容易接近，从而可能会规避驱动游离dsDNA毒性的机制。这些结果表明，DNA纳米结构可用于压缩大型ssDNA HDR模板，并可介导原代人类T细胞中内源性靶点的有效基因插入。

图4. 与非结构化dsDNA相比，包含人类基因的纳米结构化DNA可增强人类原代细胞的HDR

VLP能够实现纳米结构DNA的细胞内递送

​​​​​​​  为了探究以DNA纳米结构形式压缩ssDNA HDR模板是否可以利用Cas9-VLP改善它们向HEK293T细胞的传递。作者通过电穿孔或使用Cas9-VLP进行了对比（图5A）。7天后收集细胞并使用流式细胞仪分析mNeonGreen+细胞。与之前的结果一致，通过电穿孔递送的非结构化和结构化DNA产生了相似的HDR效率。尽管VLP递送降低了整体HDR水平，但18螺旋纳米结构模板的HDR效率与非结构化和环状模板相比提高了2.5倍。这些结果表明，纳米结构DNA可以使用VLP递送，从而为治疗或生物成像目的在体内递送到特定组织提供了可能性。此外，当结合Cas9-VLP和纳米结构HDR模板时，这些数据显示出更高的HDR效率，这是朝着创建体内基因替代或修饰疗法。

图5. VLP能够实现纳米结构DNA的细胞内递送

全文总结：

​​​​​​​  该工作验证了将纳米结构DNA传递到细胞核中的三种不同策略，并利用纳米结构DNA的设计特征及其携带遗传信息的能力，证明了其作为HDR介导的基因组编辑模板的效果，为基于DNA模板的利用Cas9-VLP进行组织选择性递送的基因编辑提供了一种新方法。

Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue 3, 22 February 2022, Pages 1256-1268