SCIENCE ADVANCES |DNA纳米结构在变构调节蛋白酶催化中的作用
大家好，今天分享的是2022年1月发表在《SCIENCE ADVANCES》上的一篇文献: The role of DNA nanostructures in the catalytic properties of an allosterically regulated protease，这篇文献研究了DNA纳米结构在变构调节蛋白酶催化中的作用。
有关作者：
通讯作者为德国杜伊斯堡-埃森大学 医学生物技术中心的Barbara Saccà教授和Elsa Sanchez-Garcia教授。Barbara Saccà教授的研究方向是利用DNA纳米技术的可预测性及可操纵性，构建复杂生物系统的简单模型。Elsa Sanchez-Garcia教授的研究方向是理论计算。
整体设计：
DNA支架酶通常表现出可改变的动力学特性，然而，我们对这种现象背后的机制仍然知之甚少。这篇文章，作者将凝血酶嵌入具有独特结构和静电特征的DNA折纸腔中，使用凝血酶作为一种可变构调节的丝氨酸蛋白酶模型来研究这个问题。作者比较了带有不同电荷的底物的水解，这些底物因为末端残基远离切割位点，可能参与凝血酶的变构激活。数据表明，底物的水解速率受DNA/底物静电相互作用的影响，并与DNA/酶束缚的程度成正比。DNA纳米结构通过改变酶附近的静电环境，可干扰酶-底物识别的电荷依赖机制并提供一种通过空间限制调节变构过程的替代工具。
在DNA-酶系统中：当酶与核酸结合时，酶催化反应的速率会发生变化。大多数研究认为酶与DNA纳米结构连接后催化效率会提高。然而，DNA-酶缀合物的早期研究显示酶与DNA连接时反应速率会降低。在这两种情况下，这种变化的程度不仅受到DNA链的序列和长度的影响，而且还受到所研究的酶和底物类型的影响。目前已经提出了几个假设来解释DNA束缚酶的催化性能变化，包括DNA链与酶和/或底物的直接相互作用；由于有利的熵贡献或静电驱动转向，蛋白质活性位点附近底物的局部浓度增加；建立pH梯度；或在DNA-蛋白质界面创建有序的水合层。所有这些假设都得到了实验证实，然而，DNA对单个DNA束缚酶的酶活性的作用仍然未全部揭示。
在本研究中，作者使用凝血酶作为模型酶来解决这个问题。凝血酶是一种胰凝乳蛋白酶家族的单体丝氨酸蛋白酶，它特异性地在碱性残基（主要是Arg）后切割肽底物。凝血酶的特点是在稍有不同的条件下其催化反应的多样性。盐的类型和浓度、缓冲液的pH值以及与凝血酶表位相互作用的肽底物末端残基的细微变化可能导致凝血酶周转数(kcat)和特征常数（KM）发生2-3个数量级的变化。由于凝血酶对结构和电荷相关因素极为敏感，因此凝血酶是测试DNA纳米结构在离子响应酶反应中的支架和静电作用的理想候选者。
DNA-酶系统的设计：
图1 DNA折纸-凝血酶系统
α-人凝血酶在不存在或存在适体配体的情况下水解合成的荧光肽底物。当存在时，适配体要么在溶液中自由扩散，要么锚定在特定形状的 DNA 折纸支架上（图1A））。因此，整个系统可以被视为由三个元素组成：酶、底物和DNA微环境，酶是系统的唯一常数项，而其他两个元素以系统的方式进行修改，以了解它们在反应动力学中的单独和组合作用。我们使用了三种不同的序列FAM-GGfPR|SGGGK(BHQ-1)K-Aaa-OH肽底物（其中Aaa是可变氨基酸）（图1）。所有底物都带有荧光共振能量转移(FRET)报告对[(FAM/BHQ-1)]，凝血酶催化底物水解导致荧光恢复。三种底物仅在C末端氨基酸(Aaa)上有所不同：在这里，Gly、Asp或Lys残基的存在导致底物在pH=7时的净电荷分别为中性(0)、负(-1)或正(+1)。相应地，三种底物表示为S(0)、S(−1)和S(+1)。
该系统的另一个变量是DNA微环境。这已被系统地改变以评估不同结构和静电因素对酶/底物对的催化性能的影响。作者使用凝血酶的核酸适体TBA1（15nt）和TBA2（29nt）分别结合凝血酶的阴离子结合位点Exo I和II，将凝血酶限制在DNA折纸结构中。已经设计了两种类型的DNA纳米结构：单层框架（表示为“矩形”）和双层立方体形状（表示为“盒子”）。两种结构都显示约20nm×20nm内腔，通过这种方式，只有一个凝血酶分子可以封装在每个适配体修饰的DNA腔室的空腔中。
图2 凝血酶催化底物S(0)水解的动力学分析
图2A根据DNA的存在与否及DNA与凝血酶的结合方式将样品分为三组：（1）w/o DNA：凝血酶、凝血酶与一种（TBA1或TBA2）或两种（TBA1/2）核酸适体，以及高离子强度磷酸盐缓冲液中的凝血酶；（2）DNA-unbound：凝血酶和含有相同浓度DNA的样品，DNA（单链、2D折纸、3D折纸）以未和凝血酶连接的形式出现；（3）DNA-bound：DNA结构腔内连接凝血酶，其中上标代表DNA结构腔内连接的核酸适体类型，核酸适体/DNA折纸连接处的结构灵活性程度由"flex"或"rig"下标表示，从而产生五个不同的结构。
DNA对凝血酶催化底物S(0)水解的影响
图3 凝血酶催化三种底物水解的动力学参数
作者通过测定底物切割导致的荧光信号的增加，监测酶的蛋白水解活性随时间的变化（图2D）。图2C结果显示所有的速率曲线都遵循米氏方程（图2B），DNA折纸束缚的凝血酶在高底物浓度下活性受到明显抑制。作者通过反应速率和图2B中的方程，提取反应的动力学参数，得到了不同情况凝血酶的kcat与KM的数值（图3）。对于S(0)，w/o DNA组中酶在溶液中自由扩散，DNA-unbound组中酶虽然被大量DNA包围，但仍然相对自由。DNA-unbound组的KM值比w/o DNA低40%，平均kcat值高15%。DNA-bound组酶大部分固定在DNA折纸结构中，该组的KM值进一步降低，kcat值相对于w/o DNA组进一步增加。在DNA-bound组，用于连接DNA腔内酶的TBA的数量和类型基本上不会影响反应的动力学参数。请注意，尽管所有样品中DNA的浓度相同(1 nM)，但DNA的总量却不同，因为所用DNA种类的分子量存在巨大差异。因此，三组酶的微观静电环境极为不同，这可能是观察到以上趋势的主要原因。
作者应用过渡态理论将反应的动力学参数与相互作用物质沿反应坐标所经历的能量变化联系起来（图4），对S(0)的分析表明，周围的DNA支架降低了ES复合物的能量，并且在更大程度上也稳定了过渡态ES‡，最终效果是降低了活化能垒。随着ΔG‡TS在DNA存在下变得更小，kcat/KM的值增加，加速了S(0)在低浓度底物时的水解。相反，这种有利的DNA诱导效应在高浓度底物（kcat占主导地位）时不太明显。这些预测与实验结果完美匹配（图2C)，证实了这种方法对解释动力学数据的适用性。
底物净电荷对凝血酶动力学的影响
图4 S(−1)、S(0)和S(+1)仅与凝血酶和与DNA连接的凝血酶反应的能量图
接下来，作者使用S(-1)和S(+1)底物进行了相同的酶促测定（图3A、B、E和F），与S(0)相比，在不存在DNA纳米结构的情况下，底物S(-1)的水解表现出KM和kcat值增加了三倍以上，而底物S(+1)的值明显较低。同样，过渡态模型可解释这种现象，在不存在DNA的情况下，向底物添加负电荷，即用S(-1)代替底物S(0)，会使ES复合物不稳定，而过渡态几乎保持不变。相反，添加正电荷，即用S(+1)代替底物S(0)具有相反的结果，即它稳定了ES复合物和过渡态，前者比后者更稳定。这阐明了这些底物的相反动力学特征，并解释了为什么在没有 DNA的情况下，特别是在高浓度下，S(-1)是比S(0)更好的底物。相反，S(+1)以完全不同的方式表现：在这里，在周围DNA环境存在的情况下添加正电荷在很大程度上破坏了ES复合物的稳定性，过渡态几乎不受影响。这转化为KM和kcat值显着增加，其中kcat/KM几乎没有受到影响。从该分析中可以得出两个主要结论：（i）酶-底物复合物的不稳定，这对于提高酶的催化性能至关重要；(ii)带正电荷的底物的不利贡献在很大程度上被周围的DNA微环境补偿，导致S(+1)在被DNA连接的凝血酶切割时的催化性能反转。这些现象说明底物的净电荷在建立与蛋白质和DNA支架的相互作用模式中起着重要作用，这对于酶促反应的有效开始至关重要。
底物净电荷和DNA支架对凝血酶动力学的联合作用
图5 蛋白质/底物的高斯加速MD（GaMD）模拟
为了更深入地了解酶-底物相互作用，作者对蛋白质/底物系统进行了高斯加速MD(GaMD)模拟（图5），探索底物C末端的电荷如何影响肽相对于Exo I的方向。结果表明，S(-1)中C端Asp残基的密度与Exo I区域重叠，而S(+1)肽中C端Lys残基覆盖的空间更侧重于不涉及Exo I的蛋白质区域。表明S(0)显示出与Exo I的静电相互作用模式，类似于S(-1)肽所表现的模式。这表明肽C末端位置的电荷可以极大地影响底物朝向Exo I的动力学。该位置的负电荷或中性电荷保持与Exo I的有利静电相互作用，因此可能通过底物与蛋白质的该调节区域的结合来触发酶激活。相反，在底物的同一位置存在正电荷足以破坏Exo I处有利的静电相互作用的模式，从而下调酶的活性。
为了进一步研究DNA支架对凝血酶动力学影响，作者还建立了一个柔性单层矩形框架的粗粒度(CG)模型。DNA折纸、凝血酶和适体大致位于同一平面上（图5D）。DNA单层非常柔韧，中空区域大小约为20 nm×20 nm（图 5E），蛋白质位于这些凹陷之一。可以合理地推测，由于DNA折纸是一种高度带电的聚合物结构，DNA表面产生的强各向异性静电场应该会影响其直接附近带正电粒子的空间分布。作者使用溶液中存在的阳离子作为探针来验证这一假设。正如预测的那样，钠离子密度图表明阳离子主要集中在折纸附近。因此，与其他底物相比，预计S(+1)分子在DNA折纸表面上积累的趋势更高，因此在中等底物浓度时已经出现明显的抑制。
全文总结：
凝血酶催化的动力学受系统的两个结构参数的影响，即底物的C端残基和DNA纳米结构的存在。前者通过蛋白质的变构调节位点影响催化反应，而后者主要通过与酶和底物的静电相互作用来调节酶的动力学行为。通过这种方式，当酶在空间上被限制在DNA纳米结构中时，酶/底物界面处的特定相互作用模式可以发生巨大变化。DNA纳米结构可以放大具有不同净电荷的底物之间的催化差异，并可用于以可编程且通用的方式调节催化反应网络。因此，鉴定和量化DNA纳米结构的静电贡献对于更深入地了解DNA支架酶的催化特征具有重要意义。
Sci. Adv. 8, eabk0425 (2022). DOI: 10.1126/sciadv.abk0425
