NAT CELL BIO丨内源性启动子驱动的sgRNA转录用于监测低丰度转录本和长非编码RNA的表达
作者:：汪俊彦
大家好，今天和大家分享一篇近期发表在Nature Cell Biology上的文章《Endogenous promoter-driven sgRNA for monitoring the expression of low-abundance transcripts and lncRNAs》，通讯作者是神经科学研究所的周海波研究员和杨辉研究员。周海波研究员课题组主要从事基因编辑工具的开发和优化，并将基因编辑技术用于重大神经系统疾病的治疗；杨辉研究员课题组主要从事基因编辑工具的开发及安全性评价，利用基因编辑技术构建动物模型，并推动基因编辑用于成体疾病的治疗。
对细胞内源性信号以及遗传电路的检测，有助于我们对生命系统的理解，以及更精确的设计信号通路，然而，相关的检测工具十分有限，特别是对细胞内低表达的长非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA) 和蛋白。为此，作者开发了一种通用性的方法，能够在内源性启动子的驱动下释放出单链sgRNA，称为内源性转录门开关 (Endogenous transcription-gated switch, Ents)。而将内源性转录们开关与高灵敏度CRISPR激活因子报告技术联用 (Suntag-P65-HSF1 and Optimized miniCMV-mCherry, SPH-OminiCMV)，能够检测内源性基因的活性，包括超低表达量的基因 (GAPDH mRNA表达量的千分之一) 以及细胞中低表达的lncRNA。
Ents的关键性设计是将sgRNA前体定向插入内源性基因的转录区，从而在内源性启动子的驱动下，转录出一条包含靶基因和sgRNA前体的转录本；然后，在内源性RNA剪接机制的作用下，释放出成熟的sgRNA (图1 a)；最后，使用CRISPR激活因子报告技术高效检测释放出的sgRNAs。
为了构建高灵敏度CRISPR激活因子报告技术，作者在N2a细胞中共转了转录激活因子复合物Suntag-P65-HSF1 (SPH)，sgRNA以及不同启动子 (Mini-TK，Luc2CP，TRE3G及miniCMV) 驱动的红色荧光蛋白mCherry的基因。其中，miniCMV启动子在没有sgRNA的情况下表现出较低的本底活性，而经sgRNA诱导后mCherry的表达量的最高 (图1 b)。此外，作者还发现，在miniCMV启动子上游使用3个拷贝数的sgRNA靶点，每个靶点之间相距35bp，诱导表达的mCherry最多 (图1 c, d)，并且，高于强启动子CAG，CMV和EF1a驱动的表达量 (图1 e)，至此，作者构建了一个高灵敏度CRISPR激活因子报告技术，称为SPH-OminiCMV。
图1. 内源性转录门开关的设计及原理。
为了考察SPH-OminiCMV系统能否检测到释放出来的sgRNA (从包含靶基因和sgRNA前体的单一转录本中释放出的sgRNA)，作者将SPH-OminiCMV系统整合到了小鼠胚胎干细胞的基因组中，并且将三种不同的sgRNA前体 (mir30、内含子剪接体、tRNA) 插入到了管家基因Actb的内含子中 (图1 f)。结果表明，只有从tRNA-sgRNA-tRNA的前体释放出来的sgRNA，才能有效诱导mCherry的表达(图1 g, h)。进一步的研究表明，不论tRNA-sgRNA-tRNA插入到5’ UTR、内含子还是3’ UTR，在蛋白水平上对Nanog基因的表达均没有显著性的影响；而插入到3’ UTR区的tRNA-sgRNA-tRNA能够轻微提高mCherry的表达 (图1 i - l)。
为了验证SPH-OminiCMV-Ents技术是否能真实反映靶基因的转录水平，作者将tRNA-sgRNA-tRNA插入到8个差异表达的基因中，即高表达的管家基因Actb和7个多能性相关基因。结果显示，基因表达水平与mCherry的荧光强度显著性相关 (图2 b, c; R2 = 0.8644, P = 0.0008)，即SPH-OminiCMV-Ents可作为报告技术，检测细胞中基因的表达。并且，相较于P2A-mCherry系统，SPH-OminiCMV-Ents技术诱导了更高水平mCherry的表达，可用于低丰度转录本的检测 (GAPDH mRNA表达量的百分之一)，例如P2A-mCherry系统无法检测到的Sox2、Tet1、Sall4和Tbx3 (图2b、c)。接下来，作者还运用SPH-OminiCMV-Ents技术追踪细胞分化过程中内源性基因的表达。将小鼠胚胎干细胞培养在N2B27培养基中，诱导其向神经前体细胞分化，据报道，在分化的过程中，多能性相关基因如Nanog、Esrrb、Sox2和Tet1的表达水平会不断降低。使用SPH-OminiCMV-Ents技术监测这些基因的表达，会发现mCherry的荧光强度在不断减弱；而监测管家基因Actb表达的SPH-OminiCMV-Ents，诱导产生的荧光强度则保持稳定 (图2 d - g)。
图2. SPH-OminiCMV-Ents追踪分化过程中低丰度转录本动态表达。
LncRNA在生物学过程中发挥着重要的功能，其表达受到细胞类型和发育阶段的限制，但由于其表达量低，无法应用荧光蛋白的策略，使得对其表达的检测和功能的分析十分困难。因此，作者考察了SPH-OminiCMV-Ents技术能否用于lncRNA的检测。结果表明，SPH-OminiCMV-Ents技术能够成功检测lncRNA Malat1及Lncenc1 (图3 a - d)。并且，在胚胎干细胞分化过程中，Lncenc1表达量的降低，会导致mCherry荧光强度的不断减弱 (图3 d, e)。
图3. SPH-OminiCMV-Ents检测lncRNA。
为了进一步增加SPH-OminiCMV-Ents技术的灵敏度，作者构建了一个前体sgRNA，其中包含6 - 8个sgRNA的串联拷贝，每个sgRNA的两侧都有一个tRNA (图4 a)。将sgRNA阵列插入不表达基因 (Sema3a; 0.000005相对于Gapdh)，低表达基因 (Tet1, 0.003195; Fzd7, 0.000050) 和lncRNAs (Lncenc1, 0.008091; Malat1 0.003989; Tug1, 0.003450) 中，结果表明，相较于单拷贝sgRNA，sgRNA阵列在所有低丰度转录本 (Tet1和Fzd7) 和两种lncRNAs中，诱导产生mCherry的水平更高；而在不表达的转录本中 (Sema3a)，不论是单拷贝sgRNA还是sgRNA阵列都不会诱导mCherry的表达 (图4 b - e)。值得注意的是，sgRNA阵列能够检测到超低表达量的Fzd7和lncRNA Tug1，而单拷贝sgRNA是检测不到的 (图4 b - f)。作者还将SPH-OminiCMV-Ents (sgRNA阵列) 插入Tubb3基因中，随着小鼠胚胎干细胞向神经元不断分化，Tubb3基因的表达量会不断增加，与此同时，会诱导表达更多的mCherry蛋白 (图4 g, h)。随后，作者将SPH-OminiCMV-Ents (sgRNA阵列) 用于构建细胞特异性内源性基因表达诱导工具。将靶向mCherry和内源性基因Ngn2或Hbb的sgRNA，以阵列形式插入Actb基因的3’ UTR中，会同时激活mCherry和内源性基因Ngn2或Hbb的表达图 (4 g, j)。
图4. SgRNAs阵列提高了SPH-OminiCMV-Ents的灵敏度，并实现了多重转录调控。
图5. 单启动子驱动dCas9和转录激活因子的同时表达，实现mCherry表达的均质性。
作者还注意到mCherry的表达在不同的细胞中会出现异质性 (图5a)。进一步的研究表明，这种异质性可能是由于dCas9蛋白和转录激活因子的表达是通过两个独立的CAG启动子实现的 (SPH (dual CAG)-OminiCMV-Ents)。为此，作者构建了一个单启动子载体 (SPH (single CAG)-OminiCMV-Ents)，同时表达dCas9蛋白和转录激活因子(图5 b)。结果显示，SPH (single CAG)-OminiCMV-Ents 不仅能够去除异质性，还进一步提高了灵敏度 (图5 b-d)，实现了对低表达lncRNA (表达量低于Gapdh的千分之一) 的检测 (图5 e, f)。
最后，作者发现使用Ents技术检测分化过程中Nanog的表达时，Nanog的表达与mCherry的表达会出现时间差 (图6 a - d)。为此，作者设计了一个诱导激活表达系统，通过加入阿霉素激活EGFP蛋白的表达，同时，使用SPH(single CAG)-OminiCMV-Ents技术进行监测 (图6 e)。结果显示，加入不同浓度的阿霉素，EGFP和mCherry的表达水平高度相关，也证明了SPH(single CAG)-OminiCMV-Ents技术对内源性基因表达动态的进行监测的可靠性 (图6 f, g)。紧接着，作者进一步研究了基因表达起始和终止时，靶基因和报告基因之间的时间差。结果表明，在信使RNA水平上，EGFP和mCherry的表达起始时间间隔约为0.5小时 (图6 h, i)，在蛋白水平上约为6小时(图6 j)；而EGFP和mCherry的表达终止时间间隔，在mRNA水平上约为4.5 h (图6 k, l)，在蛋白水平上约为24 h (图6 m)。
图6. SPH (single CAG)-OminiCMV-Ents的定量表征。
本文作者设计了具有通用性的内源性转录门开关，能够在内源性启动子的驱动下释放出单链sgRNA；并将其与高灵敏度CRISPR激活因子报告技术联用，实现了细胞内源性基因活性，超低表达量基因 (GAPDH mRNA表达量的千分之一) 以及lncRNA的动态监测，为研究这些基因元件在活细胞中的功能作用开辟了新的途径。
Gao, N., Hu, J., He, B. et al. Endogenous promoter-driven sgRNA for monitoring the expression of low-abundance transcripts and lncRNAs. Nat Cell Biol 23, 99–108 (2021).
