SCI ADV丨基于序列调控微米大小DNA液滴的动态功能

作者：秦振恒

在水中水溶性分子通过液液相分离（LLPS）形成大分子液滴。LLPS已经被用来阐明相分离的潜在机制和构建细胞样结构或生物反应器等方面。依据LLPS在生物研究领域的最新进展，在活细胞内蛋白质和RNA通过生物分子之间适度的相互作用形成分子液滴。因为液滴在调节各种生物功能方面发挥着重要的作用，因此生物分子的LLPS受到了广泛的关注。尽管有几项体外研究通过改变蛋白质、RNA和盐的浓度重现了液滴的形成，还没有研究表明通过改变生物聚合物序列编码的生物信息来控制生物大分子液滴的动态行为。

DNA具有实现称为可控大分子结构的潜力，如通过液-液相分离（LLPS）,对碱基序列进行设计达到可编程的相互作用。来自东京工业大学的Masahiro Takinoue教授在国际学术期刊《科学-进展》（Science Advance）上发表的论文《Sequence-based engineering of dynamic functions of micrometer-sized DNA droplets》[1]介绍了通过序列设计的DNA纳米结构通过LLPS构建“DNA液滴”，并通过改变它们的序列来调控DNA液滴的动态。具体来说，通过设计序列能够调控DNA液滴形成所需的温度。此外，通过序列设计和酶促反应可以对DNA液滴的融合、分离等进行控制。用序列设计的DNA修饰的蛋白质可以被捕获到特定的液滴中。作者通过设计DNA纳米结构编码信息为控制大分子液滴提供了平台，并为DNA的各种应用，如细胞模拟物、无膜细胞器的合成和人工分子系统铺平了道路。此外探索了DNA液滴技术的潜在应用，演示了蛋白质货物在特定序列DNA液滴中的捕获和分配。为DNA液体作为药物载体输送提供了基础

结果

纳米结构通过LLPS形成DNA液滴

作者设计了一个带有三个粘性末端的Y形的DNA纳米结构（简称为Y基序）（图1.A）。Y基序由三条DNA单链组成（图1.A）。Y基序的主干有16对碱基对，粘性末端有8个回文核苷酸序列，能够使得Y基序之间相互连接。通过共聚焦显微镜在加热台上观察Y基序溶液，用荧光染料对Y基序进行染色，这里用的是SYBR Gold。在70℃时，由于SE在该温度下去退火，使得Y基序分散在缓冲溶液中（“分散状态”）（图1.B）,没有观察到微米尺寸的结构。当温度降到62℃后，该温度仍远高于8-nt SE的Tm值（45.9℃），在溶液中观察到液滴形成（从几微米到几十微米）（图.2A,b）。这些液滴可能是通过成核生长过程形成的。两个液滴相撞时发生了融合（图.2B,C）。这种融合行为类似于活细胞中通过LLPS形成的液滴。DNA液滴的表面张力和SE的互补作用导致了DNA液滴的融合。光漂白后的荧光恢复实验（FRAP）实验（图.2D，E）显示荧光强度立即恢复，这表明Y基序在液滴内部可以扩散（不形成静态网络），Y基序的动态解离和结合导致了液滴的形成。之前报道了两种类型的LLPS,一是高浓度聚合物共混的LLPS，例如聚乙二醇/葡萄糖混合物，以及低浓度大分子聚集的LLPS,如蛋白质液滴。在Y基序DNA液滴体系中，DNA纳米基序的相分离属于第二种，这是因为低浓度DNA纳米基序的SEs杂交诱导了DNA液滴的形成。

图.1 DNA液滴的形成和DNA液滴的序列依赖性控制。A. Y型纳米的示意图，和形成Y基序的链的序列。B. Y基序的状态是温度依赖的。C. 控制DNA液滴融合分离等行为的示意图。D. 特定序列的DNA液滴的分割可以应用于选择性的货物捕获。

当温度进一步降低至25℃时（图.2F,G）,在观察时间内，液滴未融合。此外，在FRAP实验中荧光强度并没有立即恢复（图.2H,I）。因此在较低温度这些DNA液滴就变成了水凝胶（图.1B）。

对于形成DNA液滴，DNA浓度的范围至关重要。通常在该实验中，即使降低温度Y基序在非常高浓度条件下并不能发生相分离。因为Y基序在此条件下全部形成了胶体。相反DNA基序在较低的浓度条件下也不会形成液滴和胶体。在此研究中使用了5μM浓度的DNA观察到了DNA纳米结构的相分离。后来发现液滴的形成通过控制温度是可逆的（图2.A）。

图2. DNA液滴和水凝胶的显微镜观察。A. 带有8-nt的Y基序随着外界温度变化在分散态、液滴和凝胶之间可逆变化。B,C. 在DNA液滴状态下微球碰撞发生融合。D,E. 低温水凝胶下的液滴碰撞不能发生融合。D. FRAP 实验表明液滴状DNA光漂白后一定时间荧光恢复。H. 水凝胶状态下的液滴光漂白后荧光长时间不能恢复。

纳米结构SEs长度和分支数量对状态变化的影响

接下来作者研究了SE序列对分散态和液滴态（Td）以及液滴和凝胶态（Tg）之间的的“状态改变临界温度”的影响。首先改变SE的长度（图.3A），结果表明更长的的粘性末端往往会导致Td（图3.A实线）和Tg（图3.A虚线）的增加。这表明SEs的序列在纳米结构组装中起着重要的作用，导致了液滴或者凝胶的形成。SEs最短为4nt。

另外作者还研究了纳米结构中分支数对Td和Tg的影响。分别设计了两种纳米结构分别带4和6个分支数。结果表明随着分支数的增加Td和Tg相应升高（图3.C）。DNA液滴的形成温度高于SEs的Tm值，表明杂交不稳定的SEs对DNA液滴的形成起着至关重要的作用。这种SEs之间弱的相互作用允许纳米结构的动态结合和解离，导致了DNA液滴相应的流体行为，例如液滴的融合（图2.B,C）。

图3. 随着纳米结构的末端SEs的边长和分支数增加，Td和Tg相应增加，Td是分散相和液滴相的临界温度，Tg是形成凝胶时的温度。

DNA液滴的正交性导致选择性和排他性融合

作者希望通过对SEs序列的合理设计能够控制液滴-液滴相互作用。因为DNA是一种阴离子聚合物，两个有非互补SEs由于电排斥力而不能杂化。这将导致两种不混溶型液滴的形成。作者设计了一个带有8-nt SE “正交Y基序”,该基序与Y基序的8-nt SE序列不是互补的但它们的热力学参数几乎相同(H和Tm)（图4.A）。两种结构分别带有两种荧光。

正如预期，Y基序和正交Y基序在同种结构之间相分离形成液滴，同种颜色液滴碰撞发生融合，颜色不同液滴之间不能碰撞融合（图4.B）。为了确认两种结构的正交性和融合排他性是由于序列的正交性得到的，作者设计了一个带有六个连接基序的S型纳米结构，与两种类型的Y和正交Y基序的SEs互补。S型基序参与Y型和正型Y基序之间的交叉桥接，可以消除两种基序之间的正交性，从而形成由Y型、正交型Y型和S型基序组成的DNA液滴（图4.D,E）。由三者组成的液滴同样具有融合性（图4.F）。

图4. 序列依赖性控制DNA液滴的融合。A. Y和正交Y基序选择性融合的示意图。B. 两种Y基序形成的DNA液滴显微图像。C-F. S型结构参与两种正交Y基序DNA液滴的示意图和显微图像。

DNA液滴的分裂和分离

为了进一步证明DNA液滴的可控性，设计了一种液滴裂变的机制（图.5A,B）。一个DNA-RNA嵌合体链加入到S型纳米结构中，称为嵌合体S结构，同时带有与Y和正交Y的基序（图5.A）。两个RNA区域位于嵌合S基序的中心，核糖核酸酶A（RNase A）被用于降解RNA部分。酶促反应导致嵌合体S基序分成两个三分支的部分，分别于Y和正交Y基序相连（图5.A）。最后观察到Y基序和正交Y基序部分组成的多个液滴的分裂（图5.B）

在使用CS基序还同时使用S基序（不可被RNase分解），演示了复杂形状液滴的形成过程（图5.F,G）。S和CS基序的比例决定了添加RNase后DNA液滴的形状，表明S型基序不仅在Y型和正交型Y之间起到交叉桥的作用，而且在Y型和正交Y之间起到“表明活性剂”的作用。

图5. 基于序列设计和酶促反应的DNA液滴分裂分离。A-E. 嵌合体S基序结构，以及RNase A 降解嵌合体S基序导致DNA液滴的分离示意图和显微观察图。F,G. S和CS基序的比例决定了添加RNase后DNA液滴的形状。

选择性捕获货物并在DNA液滴中分割

将序列设计的DNA液滴与其他分子相结合，可以为更多的应用提供基础，并增加了DNA液滴的功能性，例如重点是通过DNA修饰将货物捕获到DNA液滴中。制备了具有Y-正交Y SEs的DNA -链霉亲和素缀合物(图6.A)， DNA液滴对链霉亲和素的选择性捕获示意图(图6.B)。带有SEs和正交SEs的DNA -链霉亲和素缀合物分别别被捕获到相应的Y和正交Y组成的DNA液滴中（图6.C,D）

此外，还采用了分裂成双面形DNA液滴的技术(图5F)，货物在DNA液滴中的分割(图6.E-J)。DNA -链霉亲和素缀合物均匀分布在

Y和正交Y另外混合了S和嵌合体S(图6. F,I)，加入RNase A后，DNA液滴分离链霉亲和素根据修改后的序列分散到和SE基序互补的一侧(图6. G,J)。正如所展示的，用编码交互信息的SE序列修饰靶标使得它们能够被于捕获于特定DNA液滴中，并以序列相关的方式控制它们的分配。

图6. 蛋白质在DNA液滴中的捕获和分配。A. 链霉亲和素和生物素修饰的分别和Y和正交Y SEs互补的单链DNA。B. DNA -链霉亲和素缀合物以序列依赖的方式别DNA液滴捕获。C，D. 显微图像和荧光曲线代表链霉亲和素在Y基序和正交Y基序中的定位。E-J. DNA修饰的链霉亲和素在RNase酶促嵌合体液滴分裂成哑铃型的过程中，由于联袂亲和素上DNA序列和Y与正交Y上SEs序列的特异性，链霉亲和素别选择性的分配到哑铃型液滴的一侧中。

总结

本文演示了依据编码在SE序列中的信息控制DNA相分离形成的液滴的动态行为和功能。通常，生物分子色LLPS（液滴形成）是通过疏水或静电相互作用诱导的。不同的是，本文基于序列设计（碱基对互补）系统实现了液滴的形成，增加了调控液滴行为的可控性。

液滴相互作用和动态功能的可控性（图3-5）使DNA液滴系统具有多种应用。由于生物系统是有序的动态结构，其行为受到DNA编码信息的调控。我们基于DNA的LLPS系统为人工细胞工程的发展提供了基础。此外，对DNA液滴通过序列依赖性的捕获蛋白质的演示可能会对合成生物学或人工细胞工程作出显著贡献，如由设计的分子组成的人工无膜细胞器。还有，特异性捕获货物的DNA液滴将作为一个有用的载体用于药物输送。

从材料学的角度，双面哑铃型DNA液滴（图5.G）的成功创造为在水相中构建水溶性复杂形状液滴提供了基础技术。

最后，大分子的这种自主功能可以作为发展分子机器人系统的基础。总之该系统通过编码在分子中的信息为可编程的LLPS系统提供了基础。

Sato, Y., T. Sakamoto, and M. Takinoue, Sequence-based engineering of dynamic functions of micrometer-sized DNA droplets. Sci Adv, 2020. 6(23): p. eaba3471.