NAT BIOMED ENG丨Cas9核糖核蛋白和供体DNA在体内的纳米粒子递送诱导同源性定向DNA修复
作者:徐雪梅
介绍一篇发表在Nature Biomedical Engineering的文章“Cas9核糖核蛋白和供体DNA在体内的纳米粒传递诱导同源性定向DNA修复”，本文通讯作者是美国加州大学伯克利分校生物工程系的Niren Murthy教授和Irina Conboy教授，Niren Murthy教授的研究方向为分子成像和药物递送，Irina Conboy教授的研究方向为建立多组织干细胞衰老、再生和调控的新模式以及基于CRISPR/Cas9的更有效和更安全的基因编辑疗法。
目前，针对CRISPR/Cas9系统目前主要有两种基因编辑疗法：（1）基于非同源末端连接（NHEJ）的治疗，通过诱导indel突变永久沉默致病基因；（2）基于同源定向修复（HDR）的治疗，纠正致病基因突变到野生型序列。基于HDR的疗法有可能治愈绝大多数的遗传病，因为这类疗法可以将突变的基因纠正回它们的野生型序列。然而，在体内通过HDR进行基因编辑具有挑战性，因为HDR需要同时递送Cas9、gRNA和供体DNA。然而，基于同源定向修复的治疗方法的开发具有挑战性，因为它们需要同时在体内传递Cas9蛋白、引导RNA和供体DNA。本文开发了一种由金纳米粒子与DNA结合并与阳离子内质破坏性聚合物复合而成的载体，可以将Cas9核糖核蛋白和供体DNA输送到多种细胞类型中，并通过局部注射有效地纠正导致小鼠Duchenne肌营养不良症的DNA突变最小的非目标DNA损伤。
如图1所示，在15nm直径的金纳米粒子上通过巯基键接上一层DNA链（红色），通过部分碱基互补将Donor DNA连接在DNA-Thiol上，再加入RNP复合物和正电性的高分子，通过非特异性吸附将Cas/gRNA的RNP复合物包裹在正电性高分子壳内，形成均一的纳米粒子，再通过内吞作用进入细胞内，正电性的高分子使得纳米粒子发生溶酶体逃逸后，RNP释放后最终进入细胞核内，进行同源定向DNA修复。在体系中加入一种硅酸盐，增大加入正电性聚合物之前的体系的负电性。首先对纳米粒子进行体外表征（图2），相比于任何一种组分，CRISPR-Gold具有明显的红移，GNP-DNA为522nm吸收，GNP-DNA-CasRNP为528nm吸收，而CRISPR-Gold具有546nm的吸收。Zeta电位表征表明CRISPR-Gold具有明显的正电性（≈20mV），而其它任意组分均为明显的负电性或者中性。通过跑胶分析残留Cas9蛋白与CRISPR-Gold上的Cas9蛋白相对强度，证明Cas9的loading效率为61.5±10.6%。
图1. CRISPR-Gold体内传递Cas9核糖核蛋白和供体DNA，诱导同源定向DNA（HDR）修复。
图2. CRISPR-gold的合成及表征。a, CRISPR–Gold的合成；b, 吸收光谱分析：吸收峰为522 nm GNP–DNA, 528 nm GNP–DNA–Cas9 RNP和546 nm CRISPR–Gold；c, Zeta电位分析；d, Cas9 loading效率分析。
为了证明CRISPR-Gold的活细胞内HDR活性，首先在活细胞内验证。在稳定表达BFP的HEK293细胞中加入CRISPR-Gold，此CRISPR-Gold的Donor DNA可以将表达BFP的基因修改为表达GFP的序列。孵育一段时间后用流式表征BFP转化为GFP的效率为11%（图3a）。通过加入各种介导内吞的物质的抑制剂，发现染料木素、甲基-β-环糊精和4°C均显著抑制CRISPR-Gold的摄取，而基于网格蛋白的内吞抑制剂则不起作用。说明HEK293细胞对CRISPR–Gold的摄取依赖于非网格蛋白介导的内吞作用，即小窝/筏依赖的。图3c表示HDR效率与各种抑制剂的相对关系，染料木素、甲基-β-环糊精对HDR效率的抑制作用最明显，进一步证明CRISPR-Gold的摄取是小窝/筏依赖性的。通过与Lipofectamine和Nucleofection转染方式相比，CRISPR-Gold内吞作用具有更高的HDR效率及更小的毒性（图3d）。Sanger测序进一步表明CRISPR-Gold在hES中诱导HDR。在CRISPR-Gold处理的人类胚胎干细胞上进行CXCR4基因的PCR，测序结果证实存在12 bp的插入。
图3. CRISPR–gold诱导活细胞中HDR. a, CRISPR–Gold能够诱导BFP-HEK细胞HDR转化为GFP通过递送Cas9 RNP和Donor DNA；b, CRISPR–Gold的摄取是小窝/筏依赖性内吞作用；c, HDR效率与各种内吞介质抑制剂的关系；d, CRISPR与Lipo转染和核转染具有更高的效率和更小的毒性；e, Sanger测序表明HDR之后存在12bp的插入。
在mdx小鼠（抗肌营养不良基因缺陷）中利用CRISPR-Gold来编辑抗肌营养不良基因，如图4所示，在活体实验中，CRISPR-Gold与Lipo转染核核转染依然具有更高的HDR效率达到3.4%。Weston表征证明在野生型小鼠中具有抗肌营养不良蛋白表达，而mdx小鼠利用CRISPR-Gold处理后也会有抗肌营养不良蛋白表达。而且，与核转染方式相比，CRISPR-Gold与Lipo转染具有更高的小鼠存活率，说明CRISPR-Gold的毒性较小。
图4. CRISPR–gold诱导HDR并促进原代成肌细胞中抗肌营养不良蛋白的表达。a，用CRISPR-Gold编辑mdx小鼠原代成肌细胞中的dystrophin基因；b，抗肌营养不良蛋白在肌管中表达，抗肌营养不良蛋白与CRISPR-Gold编辑的原代mdx成肌细胞；c，CRISPR-Gold对原代成肌细胞的毒性最小，而核转染引起的毒性显著。
为了证明CRISPR-Gold在肌肉组织中的基因编辑功能。将CRISPR-Gold注射入Ai9小鼠（DNA序列中的stop基因缺失会导致荧光td番茄蛋白的表达）。结果显示CRISPR–Gold可在Ai9小鼠中递送Cas9 RNP并产生基因缺失，并且CRISPR–Gold的基因编辑效应可在注射部位的毫米之外观察到。证明CRISPR-Gold可以在体内有效地传递Cas9RNP并编辑基因组DNA。如图5所示，在大片组织细胞中观察到了番茄荧光表达，说明CRISPR-Gold在组织细胞中成功地进行了基因编辑。
在证明CRISPR-Gold可以实现活体内基因编辑后，将CRISPR-Gold用于肌萎缩小鼠的基因HDR修复。如图6所示，CRISPR-Gold具有较高的HDR效率，注射两周后，取肌肉组织，通过肌肉组织的冷冻切片中观察到强烈的抗肌营养不良蛋白表达，观察到CRISPR–Gold治疗的mdx小鼠的肌肉纤维化水平降低，这表明组织健康状况更好。通过CRISPR-Gold的注射可以显著降低肌纤维化水平。
图5. CRISPR-gold诱导Ai9小鼠肌肉组织基因编辑。a、CRISPR-gold注射到Ai9小鼠体内，Ai9基因中停止序列的基因缺失；b、单次CRISPR-Gold注射后腓肠肌的番茄荧光成像；c、在大面积的肌肉中观察到了td番茄蛋白的表达。
图6. CRISPR-gold在CTX刺激下促进mdx小鼠肌萎缩蛋白基因和肌营养不良蛋白表达的HDR，并减少肌肉纤维化。a、CRISPR-gold后腿肌肉注射；b、CRISPR-gold的HDR效率更高；c、冷冻切片中观察到强烈的抗肌营养不良蛋白表达；CRISPR–Gold治疗的mdx小鼠的肌肉纤维化水平降低，这表明组织健康状况更好；d、CRISPR–gold可减少mdx小鼠的肌肉纤维化。
总结：本文证明CRISPR-Gold可以在体内或体外递送Cas9蛋白、gRNA和供体DNA，并通过HDR编辑基因。CRISPR-Gold为治疗由点突变和小缺失引起的DMD提供了一种新的治疗策略。对于这类患者，CRISPR-Gold有可能在不使用病毒的情况下，将其突变纠正回野生型序列，并再生功能完全正常的野生型肌营养不良蛋白。更广泛地说，研究结果表明，非病毒载体可以在体内产生HDR，在治疗遗传性疾病方面有很大的潜力。
Kunwoo Lee, Michael Conboy, Hyo Min Park, Fuguo Jiang, Hyun Jin Kim, Mark A. Dewitt, Vanessa A. Mackley, Kevin Chang, Anirudh Rao, Colin Skinner, Tamanna Shobha, Melod Mehdipour, Hui Liu, Wen-chin Huang, Freeman Lan, Nicolas L. Bray, Song Li, Jacob E. Corn , Kazunori Kataoka, Jennifer A. Doudna, Irina Conboy* and Niren Murthy2*. Nature Biomedical Engineering. 2017, 1: 889-901.
