ANGEW丨L-RNA适体——肽结合物的合理设计用于细胞高效摄取和G-四链体介导的基因调控

大家好，今天我要和大家分享一篇2024年2月在Angewandte Chemie上发表的文章，题目是“Rational Design of L-RNA Aptamer-Peptide Conjugate for Efficient Cell Uptake and  G-quadruplex-Mediated Gene Control”。这篇文章的通讯作者是香港城市大学化学系的郭俊杰教授，他的研究主要集中在G-四链体结构与功能、RNA生物学与基因调控以及核酸适体的开发与应用方面。

 

研究背景

RNA G-四链体（D-rG4s）是一种在细胞转录组中广泛存在的结构，对各种生物过程起着至关重要的调节作用。研究表明，L-RNA适体具有强大的特异性和亲和力，可以识别和结合功能性rG4s。然而，由于L-RNA适体在穿透细胞方面的能力较差，限制了其在生物学上的应用。为了克服这一限制，研究人员合理设计了一种L-RNA适体-肽偶联物，旨在提高L-RNA适体在细胞内的穿透能力。

 

结果与讨论

1. L-RNA适体—CPP偶联物的点击反应产率

L-Apt.4-1c是目前最短（25 nt）L-适体，其可以与rG4s（RNA G4）结合但不与dG4s（DNA G4）和非G4s结合。但L-RNA细胞穿透性差，需要开发一种独特的策略来增强L-RNA适体的细胞穿透性。Cell-penetrating-peptides(CPP)是一种短肽，在生理条件下大多带正电荷，可以直接穿透细胞膜或通过内吞作用进入细胞。作者通过CuAAC反应使L-Apt.4-1c与CPP偶联，在L-Apt.4-1c的5’端修饰己炔基，在赖氨酸的侧链修饰叠氮化物，在其羧基端和氨基端通过linker连接CPP和四甲基罗丹明，在一价铜的催化下，实现L-Apt.4-1c和CPP的偶联（参见图1A）。PAGE实验表明偶联物的高效合成，且产率可达94%（参见图1B）。

 

2. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c对hTERC D-rG4具有较强的结合亲和力和特异性

为了提高L-Apt.4-1c对特定靶标（hTERCD-rG4）的结合能力，研究者们对CPP（细胞穿透肽）的结构进行了精心的优化（参见表1）。他们首先在保持CPP基本长度不变的基础上，设计了三种不同序列的CPP，并利用微量热泳动（MST）技术对它们进行了亲和力测试。结果显示，含有Tamra_R8序列的CPP具有最强的亲和力，其Kd值远低于其他两种序列的CPP。

接下来，研究者们在所有CPP序列均由多聚精氨酸构成的基础上，尝试引入了不同的连接子（linker）。MST实验再次证明了含有Ahx连接子的CPP（特别是Tamra_Ahx_R8_L-Apt和R8_Ahx_Tamra_L-Apt）具有较低的Kd值，表现出更强的亲和力（参见图2A-B）。然而，在合成过程中，R8_Ahx_Tamra_L-Apt比Tamra_Ahx_R8_L-Apt更难制备。因此，研究者选择了Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c作为后续实验的候选对象。为了验证CPP的偶联是否会影响L-RNA适体对rG4的结合，研究者们进行了电泳迁移率测定（EMSA）实验。结果表明，Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c与未偶联的L-Apt.4-1c在结合靶标hTERC D-rG4方面的能力是相当的，这表明CPP的偶联过程并未改变L-RNA适体的结合特性(参见图2C-D)。

最后，研究者们还测试了Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c对靶标hTERC D-rG4突变体的结合能力。实验结果显示，Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c与突变体之间并没有显著的结合，这一发现进一步证实了该CPP-L-RNA适体复合体对特定靶标的高亲和力和选择性(参见图2E-F)。

 

3. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c能穿透到细胞质中并与rG4基序特异性结合

研究者们对Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c的细胞摄取能力和对靶标特异性结合进行了评估。实验开始时，他们利用Lipofectamine 2000将带有5’FAM标签的hTERC rG4野生型（WT）或突变型（Mut）序列转染到HeLa细胞中。在转染完成4小时后，他们替换掉含有Lipofectamine 2000的旧培养基，并加入了新鲜的含有Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c的培养基，继续孵育两小时。随后，使用DAPI染料对细胞进行染色，并进行了共定位分析，以评估细胞对Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c的摄取效率（参见图3A）。

通过共聚焦显微镜成像，研究者们观察到，经过Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c处理的细胞显示出与FAM标签共定位的荧光信号，而在未转染外源rG4的细胞中，几乎没有检测到这种共定位的荧光信号。这一结果表明，Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c主要与细胞内转染的rG4序列发生相互作用（参见图3B）。此外，研究者们还比较了转染了FAM标签的hTERC rG4突变型和野生型的细胞。结果显示，转染突变型rG4的细胞中Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c的荧光强度明显低于转染野生型rG4的细胞。这说明Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c能够在细胞内具有特异性地识别并结合野生型的rG4序列（参见图3C）。这一发现对于开发针对特定基因序列的治疗策略具有重要意义。

 

4. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c在EGFP报告基因检测中负调控基因表达

为了探究Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c对细胞内基因调控作用的影响，研究者们采用了一种创新的实验设计。他们构建了含有hTERC rG4野生型（WT）或突变型（Mut）序列的EGFP报告基因质粒，这些序列被放置在EGFP基因的5'非翻译区（5'UTR）。同时，为了确保实验结果的准确性，他们共转染了pmCherry-N1质粒作为内部参照，以便对转染效率和荧光强度进行标准化（参见图4A）。在转染过程完成后的4小时，研究者们向HeLa细胞中加入了Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c。实验结果显示，在没有添加Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c的情况下，含有pEGFP-N1-hTERC_rG4 WT构建体的细胞中标准化后的EGFP表达水平低于含有pEGFP-N1-hTERC_rG4 Mut构建体的细胞，这表明rG4结构的形成对基因表达具有调控作用（参见图4B-C）。进一步的实验观察到，Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c能够有效抑制含有pEGFP-N1hTERC_rG4 WT构建体的细胞中EGFP的表达，而对含有pEGFP-N1-hTERC_rG4 Mut构建体的细胞中的EGFP表达没有影响（参见图4D-E）。这一发现揭示了Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c在调控特定基因表达方面的潜力，特别是在靶向和抑制特定基因序列表达的应用前景上。

 

5. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c能抑制5'UTR rG4介导的细胞翻译

为了深入探究Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c对rG4结构介导的基因调控效应，研究者们采用了双荧光素酶报告基因分析方法。他们将hTERC rG4的野生型（WT）或突变型（Mut）序列插入到荧光素酶基因的5'非翻译区（5'UTR），并将荧光素酶信号与同一质粒中的萤火虫荧光素酶进行标准化（参见图5A）。实验结果显示，含有hTERC rG4 WT序列的构建体在标准化后的荧光素酶活性上低于含有hTERC rG4 Mut序列的构建体，这表明rG4结构对基因表达具有负向调控作用（参见图5B-C中的灰色柱）。值得注意的是，Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c能够有效抑制含有hTERC rG4 WT序列的构建体中的荧光素酶活性，而对含有hTERC rG4 Mut序列的构建体中的荧光素酶活性没有影响（参见图5B-C中的红色柱）。作为对照，单独的Tamra_Ahx_R8肽和L-Apt.4-1c在没有转染试剂辅助下，均不能调节荧光素酶活性（参见图5B-C中的粉色和蓝色柱）。此外，为了排除培养基中可能残留的转染试剂对Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c细胞摄取能力的潜在干扰，研究者们采用了两种方法：一是直接将质粒和Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c加入到细胞中，二是使用转染试剂将质粒和Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c共转染入细胞。结果显示，在两种方法中，Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c在存在时，hTERC rG4 WT组的标准化荧光素酶活性均表现出相似的基因抑制效果（参见图5B-D中的红色柱），而L-Apt.4-1c只有在共转染的情况下才能抑制基因表达（参见图5B-D中的蓝色柱）。这表明CPP在没有转染试剂辅助的情况下，依然能够有效地促进细胞对L-RNA适体的摄取。对于hTERC rG4 Mut组，两种方法均未表现出基因调控作用（参见图5C-E）。为了验证Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c在基因调控中的广泛应用潜力，研究者们还研究了其对mRNAs不同区域的rG4序列的影响。他们将NRAS rG4的野生型（WT）或突变型（Mut）序列插入到荧光素酶基因的5'UTR中，并进行了双荧光素酶报告基因分析（参见图5F）。结果表明，Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c能够以浓度依赖的方式抑制NRAS rG4 WT介导的荧光素酶活性（参见图5G），而对NRAS rG4 Mut构建体的荧光素酶活性没有影响（参见图5H）。这些发现进一步证实了Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c在基因调控方面的高效性和特异性。

6. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c抑制3’UTR rG4介导的细胞翻译

另一方面，淀粉样前体蛋白（APP）转录物的3'非翻译区（UTR）中存在一种名为rG4的结构，它能负向调控APP蛋白的表达。为了进一步探究Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c对APP蛋白表达的潜在影响，他们采用了双荧光素酶基因报告系统进行分析。在这个系统中，APP rG4的野生型（WT）或突变型（Mut）序列被插入到荧光素酶基因的3'UTR中（参见图6A）。实验结果表明，Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c能够显著抑制含有APP rG4 WT序列的荧光素酶活性，而对含有APP rG4 Mut序列的构建体则没有影响（参见图6B-C）。此外，研究者们没有观察到荧光素酶mRNA水平的显著差异，这一发现表明Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c主要在翻译层面而非转录层面调节APP rG4的活性（参见图6D-E）。综上所述，研究者们成功开发了一种新型的L-适体-CPP偶联物，这种偶联物能够在无需使用转染试剂的情况下提高L-Aptamer的细胞摄取效率。更为重要的是，他们证实了Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c具有识别并结合细胞内rG4结构的能力，并且能够以rG4依赖的方式抑制翻译过程。这一突破性的发现为未来针对特定基因序列的治疗策略提供了新的可能性。

文献来源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202310798