Nat Commun | 可溶性多价Jag1 DNA折纸纳米图案无需牵引力即可激活Notch

大家好，今天给大家分享一篇2024年发表在Nature Communications上的文章，题目为“Soluble and multivalent Jag1 DNA origami nanopatterns activate Notch without pulling force”。

通讯作者：

本文的通讯作者是卡罗林斯卡学院的Björn Högberg教授，他的主要研究方向是利用基于DNA纳米技术的新工具研究受体信号和药物传递。

研究背景：

Notch信号通路是多细胞生物体内一类高度保守的信号通路，通过参与细胞间相互作用介导外界环境对细胞的影响和调控，在生物体的早期发育中程序性地操控细胞的命运和组织的分化。在哺乳动物中，Notch受体（NECD）的胞外结构域由一个NRR负调控区和多个EGF重复序列组成（图1a）。Notch受体的激活依赖于在受体三个切割位点进行的三个蛋白水解过程: Notch跨膜区胞外端的S1酶切位点被furin蛋白酶切割，在结合配体后在S2酶切位点被ADAM金属蛋白酶切割，最后经跨膜γ分泌酶(S3)介导的切割，使得Notch胞内结构域(NICD)释放。然后NICD易位到细胞核形成转录激活子复合物，激活相关靶基因的表达（图1b）。

以往研究报道Notch受体激活模型与拉力诱导构象变化有关，虽然该模型已经在微观尺度进行了研究，但Notch在溶液中的激活机制尚未清楚。基于此，作者设计了可控的Jag1纳米结构，将Jag1-fc分子与DNA寡核苷酸共价结合，形成精确控制的多价Jag1结合物，以揭示Notch复杂的激活机制(图1c)。

图1 Notch通路示意图及实验原理

结果与讨论：

首先，作者将不同数量的Jag1蛋白固定在棒状DNA折纸结构上，通过琼脂糖凝胶成像、DNA-PAINT成像、透射电镜观察以及SPR实验进行表征(图2)，实现了可控的Jag1纳米图案（Jag1 nanopatterns，JNP）。

 

 

 

图2 Jag1Fc DNA纳米图案的表征

随后，作者验证了多价JNP可以激活Notch。使用神经上皮样干细胞(lt-NES)作为模型，用不同的JNPs溶液刺激这些细胞(图3a)。通过免疫染色证实了Notch的存在(图3b)。通过不同时间处理、增加JNP数量以及提高总蛋白浓度，证明多价性是Notch激活的最重要因素（图3c-e）。通过邻位连接技术，发现8倍JNP刺激时，每个细胞的PLA信号明显更多，再次验证Notch被激活（图3f）。最后，作者使用0×、1×和8×JNP处理细胞，并对样品进行RNA测序，在三种情况下的聚类热图显示出不同的概况(图3h)，同时揭示了许多Notch相关基因在JNPs刺激后上调(图3i, j)。

 

图3 JNP对Notch的激活

接着，作者验证了细胞间的作用力与多价JNP激活Notch无关。考虑到Jag1纳米结构和细胞膜之间由于相互负电荷而产生斥力(图4a)，用低聚赖氨酸(K10)溶液涂覆JNPs来屏蔽其电荷，从而最小化它们与膜之间的斥力。观察到，屏蔽DNA纳米结构的负电荷并没有降低HES1基因的相对水平，这表明静电斥力并没有介导Notch激活(图4a)。接着，使用qPCR检测DNA折纸支架表面的痕量浓度，结果表明，表面附着力与Notch激活无关(图4b)。作者还探讨了由受体内吞后细胞膜内陷产生的力，在细胞刺激实验中使用内吞抑制剂，观察到多价效应没有变化(图4c)，同时也没有观察到已知参与内吞过程的基因的表达有显著差异(图4d)。最后，作者利用ADAM10抑制剂处理了细胞，结果表明Notch激活是配体依赖的(图4e)。

图4 细胞间的作用力与Notch激活无关

上述结果表明Notch的激活可能是在没有配体施加拉力的情况下发生，但是作者的问题是，Notch激活的多价效应是由于受体的聚类，还是主要由于配体受体的结合亲和性和结合时间的增加引起的(图5a)。作者将单个Jag1Fc定位在DNA纳米结构的中间，并在距离Jag1Fc约70 nm的两侧各添加一条胆固醇修饰的DNA链(图5b)。发现在JNP上加入胆固醇导致Notch通路激活更加明显 (图5d)，这意味着延长受体结合时间更有利于激活Notch。为了进一步研究控制Notch的激活可能取决于增加与配体相互作用的时间，随后制作了另一种嵌合DNA纳米结构，用BAI1蛋白取代Jag1配体，观察到单独的BAI1蛋白不会激活Notch通路，但当它与1x Jag1Fc蛋白一起放置在DNA纳米管上时，激活水平与4x JNP相同(图5e)。最后，作者讨论了Notch的激活机制。根据作者的实验结果，在溶液中激活Notch并不需要力的作用，这与当前Notch的拉伸杆结构模型有冲突（图5f）。但如果Notch是蜷缩折叠成复杂的三级结构（图5g），那么作者的实验结果是当前Notch力模型的补充，对Notch的负调节区（negative regulatory region, NRR）施加力的作用有助于Notch激活。

图5 受体结合时间延长有利于激活Notch和新模型的提出

总结：

总的来说，本文通过设计可控的Jag1纳米图案，证明Notch通路可以以一种不依赖于力激活机制的方式从溶液阶段激活，揭示了受体结合时间长短是多价JNP激活Notch的关键因素，为可溶性激动剂的开发奠定了基础。

文献信息

Smyrlaki I, Fördős F, Rocamonde-Lago I, Wang Y, Shen B, Lentini A, Luca VC, Reinius B, Teixeira AI, Högberg B. Soluble and multivalent Jag1 DNA origami nanopatterns activate Notch without pulling force. Nat Commun. 2024 Jan 18;15(1):465.