JACS | DNA介导多肽组装蛋白质模拟物
今天分享的是近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的一篇文章，题目为DNA-Mediated Peptide Assembly into Protein Mimics
作者简介：
本文的通讯作者是来自麦吉尔大学化学系的Hanadi F. Sleiman教授，该课题组的主要研究方向为利用DNA作为模板来组装纳米结构材料。
研究背景：
蛋白质由20种天然氨基酸和四个层次的结构组成，在生命活动的众多方面发挥着至关重要的作用。随着计算化学的进步和对蛋白质折叠原理的理解，已经从头设计产生了许多具有新结构和功能的蛋白质。然而，由于蛋白质复杂的序列空间和结构，这个过程仍然具有挑战性。为此，研究者将具有可预测结构的短肽片段组装来形成新蛋白质。例如，将多个α-螺旋通过相互缠绕形成交叠的螺旋-螺旋基序，并能够通过金属离子螯合、共价连接或与有机分子结合等方式来进一步稳定其二级和三级结构。此外，肽-肽的相互作用也可以通过超分子模板来稳定。其中，DNA因其序列的可编程性和互补配对的稳定性，可以产生许多具有不同结构和形状的基序。因此，以DNA为模板引导多肽自组装将产生具有更多结构和功能的新蛋白质模拟物。
前期研究者表明DNA链能够被设计为丰富的支架结构，并与多种功能材料如聚合物、纳米颗粒共价连接。因此，本文主要介绍了一种新型蛋白质从头设计的方法，研究者将DNA链结构与多肽相连，通过与预先设计的DNA互补链模板杂交，辅助多肽间的组装。从而生成可调控的二级或三级结构的新蛋白质模拟物，随后通过小分子进一步共价固定，形成带有DNA链标签的从头设计蛋白质（图1）。
图1. DNA-多肽新型蛋白质从头设计策略
结果与讨论：
1. 蛋白模拟物库的组装和合成
作者将该方法应用于具有螺旋结构的多肽库（表1）。P1、P2、P3是根据三聚体卷曲折叠原理设计的多肽序列，各由21个氨基酸组成。异亮氨酸位于a和d位置，促进三聚体线圈的形成，带相反电荷的氨基酸位于e和g位置，以提供额外稳定的相互作用。通过固相肽合成(SPPS)方法合成多肽序列，其中在N端添加炔基作为把手，C端添加半胱氨酸残基与DNA共价相连。不同的多肽序列分别与DNA相连后，再与模板链结合。DNA组装后，用三氮化苯小分子通过Cu(I)催化叠氮化物-炔环加成(CuAAC)将II中的炔把手共价锚定在一起（图2）。所有偶联步骤均能够高效反应，并且通过HPLC纯化得到最终的蛋白质模拟物。
表1 多肽序列及其颜色编码
图2. DNA-肽作为蛋白模拟物的合成过程示意图
2. 蛋白模拟物结构分析
作者利用SDS-PAGE表征了DNA-肽的组装，并用圆二色光谱（CD）研究了DNA支架、共价锚定接和多肽一级序列对蛋白质模拟物二级和三级结构的影响。作者首先研究长度为3个的七肽重复组成的异三聚体螺旋束，CD光谱在202 nm处的信号峰，对应随机螺旋束的二级结构。将三聚体DNA-肽杂合体与三聚体支架组装在一起，在208和222 nm处观察到具有两个负峰为α-螺旋结构。通过DNA模板和小分子钉接结构约束后，发现其两个峰的比值趋于一致，这表明α-螺旋相互作用形成一个卷曲螺旋（coiled coil）结构（图3）。
图3. 3个七肽重复序列形成的蛋白质模拟物的残基相互作用示意图和CD光谱。
作者利用DNA模板组装长度较短或相互作用弱的多肽，拓展了蛋白质模拟物的构建。并通过变性凝胶电泳表征，经过相似的纯化过程，能够形成高效的螺旋-螺旋基序(图4) 。
图4. 12%尿素变性PAG凝胶分析蛋白质模拟物库的合成
之后作者使用CD表征了不同多肽序列间形成的蛋白质模拟物的二级结构。比较了对于两个肽重复序列间是否形成卷曲螺旋结构、弱相互作用的肽序列间是否卷曲螺旋结构以及不同多肽间是否异质蛋白模拟物。一共测试了十种由不同种类多肽构成的同源或异源三聚体结构，进一步研究DNA链模板、共价接合物以及多肽一级序列对蛋白质模拟物二级和三级结构的影响 (表2) 。从各个蛋白质模拟物的CD光谱汇总结果中可以发现，DNA支架确实能在一定程度上辅助原本不能形成螺旋-螺旋相互作用的多肽链形成相互作用，仅有无形成疏水核心的E6组、α-螺旋裸露的残基带有静电斥力的E7和E9组仍旧不能形成螺旋间相互作用。
表2 所构建的十种不同蛋白模拟物的不同二级结构
3. DNA链对蛋白模拟物构象的影响
作者首先研究了DNA与多肽之间的距离对蛋白模拟物构象的影响。通过CD光谱观察到当连接子Tx=1 T (~ 4.9 Å)时，208 nm和222 nm处两峰强度的比值从0.8增加到1.0，表明螺旋间相互作用力促进。随后再增加连接子长度，蛋白质模拟物间的螺旋-螺旋相互作用逐渐消失。此外，作者在E4三聚体蛋白模拟物的其中两条编码DNA的互补链之间引入一个15 bp的连接子使对应的两条多肽链向外延展，以及E5三聚体通过单链DNA与3WJ支架组装形成蛋白模拟物，结果表明这两种DNA结构均使螺旋-螺旋相互作用完全消失（图5）。表明附着的DNA支架可以完全控制蛋白模拟物的二级构象。
图5. DNA链的空间结构对蛋白质模拟物的二级结构的调控
4. 蛋白质模拟物相互作用的热稳定性
变温CD光谱显示随温度升高，在205−208 nm处的负峰移至200 nm左右，而 222 nm处的负峰信号增加。表明该模拟物从螺旋-螺旋相互作用向无规卷曲结构转变。之后作者以222 nm和245 nm处的信号对温度作图，发现两条曲线存在较强的关联性，表明组装体结构是通过DNA碱基配对和肽-肽的相互作用来稳定的。并且随着温度升高发现两个明显的突跃，表明该模拟物首先发生了多肽间相互作用力的破坏，当温度升高到63 ℃左右后，发生了DNA的变性，双链间的碱基互补配对被破坏，模拟物完全裂解 (图6) 。
图6. 蛋白质模拟物的热稳定性
总结：
综上所述，作者设计了一种简单和通用的模块化DNA模板策略来组蛋白质模拟物。利用共价连接的DNA小分子作为支架，实现肽单元的快速组装。与传统的依赖于肽-肽相互作用的组装方法不同，这种方法允许任意的肽二级结构以模块化的方式交联。高度可编程的DNA的引入进一步调节多肽序列构象，为组装过程增加了额外的控制单元和功能单元，丰富了所能得到蛋白质模拟物的结构。这种模块化策略将促进DNA编码蛋白文库的开发，为快速发现新的治疗方法、酶和抗体模拟物提供了参考。
Fangzhou Zhao, Martin Frandsen, Sabrina Capodaglio, and Hanadi F. Sleiman. DNA-Mediated Peptide Assembly into Protein Mimics. J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 1946–1956. https://doi.org/10.1021/jacs.3c08984.
