Chem丨人工细胞组装逻辑门与电路的生物催化编程
大家好！今天分享的是一篇于2025年1月发表在Chem上的论文，题目为“Biocatalytic programming of protocell-embodied logic gates and circuits”，通讯作者为来自布里斯托大学的Stephen Mann教授。这项研究构建了嵌入酶催化网络的人工细胞阵列，实现了布尔逻辑门与级联电路操作，为分布式计算、动态反馈调控及模块化信号处理提供了灵活的平台(图1)。
图1.图片摘要
引言
活细胞采用复杂的区室化策略和反应-扩散原理来协调错综复杂的多酶级联反应，从而实现对化学输入信号的处理。生化信号输入向功能输出的转化是由细胞内生物分子电路中编码的分子识别事件和反应动力学介导的，其运作方式类似于电子逻辑电路。受此启发，合成生物学构建了多种仿生区室系统，并结合人工生物分子电路，实现了区室间通讯及适应性响应等复杂功能。当前的人工生物分子电路研究聚焦于DNA电路与酶电路，虽然前者具有高度可编程性和精确的分子识别能力，但酶电路能够更灵活地调控和耦合并行、竞争、抑制等复杂功能构建化学反应网络。基于酶的电路已在溶液与水凝胶中进行了探索，但将其整合至人工细胞群落中进行基于人工细胞的计算和通信并构建分布式计算系统，仍未得到充分研究。在这项工作中，作者开发了声学图案化酶编码人工细胞阵列，通过空间编程实现嵌入式酶逻辑电路（Embodied Enzyme Logic Circuits, EELCs），支持单人工细胞或群体水平的布尔逻辑运算并输出持续或脉冲信号(图2)。
图2.EELCs工作简介
结果与讨论
1.酶编码人工细胞内的逻辑门运算
作者首先利用声学图案化技术，将酶编码的 PDDA/ATP 凝聚体组装成空间有序的人工阵列，并进一步构建了多种人工细胞内的酶逻辑门。在AND门构建中，作者将葡萄糖脱氢酶（GDH）包封于凝聚体微滴内，仅在共同输入葡萄糖（Glu）和NAD+时，才能生成有荧光的NADH（图3A）。在OR门中，共包封葡萄糖氧化酶（GOx）、半乳糖氧化酶（GaOx）与辣根过氧化物酶（HRP）于微滴内，输入Glu或半乳糖(Gal)时，体系均能生成H₂O₂，从而介导HRP催化产生2,3-DAP荧光输出（图3B）。此外，作者还构建了NOT门，将HRP包封于微滴内，当输入H₂O₂时，NADH被HRP氧化，荧光逐渐衰减，而无H₂O₂输入时，荧光得到维持（图3C）。
图3. 酶编码人工细胞内的逻辑门运算
2.在可重构人工细胞中执行酶逻辑门运算
进一步，作者构建了可诱导人工细胞结构重构的OR和INHIBIT门。在OR门中(图4A-C)，向包封GOx和酯酶（Est）的PDDA/Fmoc-AA微滴阵列中注入葡萄糖（作为 input A）或乙酸乙酯(EtOAc)（作为 input B），两者均可介导微滴酸化（图4D），诱导Fmoc-AA质子化，进而触发微滴水凝胶化（图4E）。此外，在 INHIBIT门中（图4F），当输入葡萄糖(input B)后，微滴内的己糖激酶（Hex）使ATP转变为ADP，导致PDDA/ATP微滴解体，微滴内荧光信号随之消失（图4G-I）。当补充ATP(input A)后，PDDA/ATP微滴可重新组装，并捕获荧光分子，从而恢复荧光，最终实现了三个脉冲循环（图4J）。
图4.可重构的人工细胞中的酶逻辑运算
3.单个人工细胞内的酶逻辑电路
作者通过在单个人工细胞内串联不同酶逻辑门，构建了嵌入式酶逻辑电路（EELCs）。首先是OR-INHIBIT串联电路：蔗糖（input A）或麦芽糖（input B）输入在OR门中被蔗糖酶（Inv）或α-葡萄糖苷酶（α-glu）催化生葡萄糖，随后葡萄糖被GOx氧化产生H⁺，诱导PDDA/Fmoc-AA凝聚层液滴阵列的结构重构（水凝胶化）。然而，若同时输入尿素（input C），则构成INHIBIT门的脲酶将催化生成OH⁻，抑制水凝胶形成（图5A-B）。接着是 NOR-AND电路：在AND门中，甲醛（input A）和NAD⁺（input B）在甲醛脱氢酶（FDH）催化下生成NADH荧光。同时，NOR门中的葡萄糖（input C）或半乳糖（input D）在酶催化下生成H₂O₂，能够抑制FDH活性。因此，仅当C和D关闭、A和B开启时，才产生荧光输出（图5C-D）。最后，为增加电路复杂度，作者构建了OR-AND-AND串联电路。其中，OR门响应蔗糖（input A）或麦芽糖（input B）输入并产生葡萄糖信使，随后在ATP（input C）和NAD⁺（input D）均存在时，AND-AND门依次催化葡萄糖为荧光NADH（输出）。实验表明，仅当ACD或BCD的输入组合时，才能观察到荧光信号输出（图5E-F）。
图5. 单个人工细胞内的酶逻辑电路
4.空间编程人工细胞群落中的集成酶逻辑电路
随后作者在空间编码的人工细胞群落中实现了集成酶逻辑电路(EELCs)设计。在概念验证实验中，作者分别将包封Inv（模块1）、GOx（模块2）和HRP（模块3）的三个人工细胞群落进行空间组织，构建了YES-YES-YES串联电路。蔗糖(input A)输入触发模块1生成葡萄糖信使，葡萄糖扩散至模块2转化为H₂O₂，并随后激活模块3产生荧光输出（图6A-C）。此外，他们还构建了YES/OR-OR层级电路，模块1（β-gal，YES门）和模块2（α-glu/Inv，OR门）分别将乳糖（input A）/蔗糖（input B）/麦芽糖（input C）转化为葡萄糖，模块3（GOx/HRP，下游OR门）接收葡萄糖并产生荧光输出（图6D-E）。实验表明，除（0,0,0）外的所有输入状态均可观察到荧光输出，证实了YES/OR-OR电路的可行性（图6F）。
图6. 分隔人工细胞群体中的信号处理
5.在人工细胞群落中构建集成反馈电路
最后，作者在空间编码的人工细胞群落中构建了具备时间调控功能的EELCs。在第一个案例中，模块1（GOx）作为YES门，模块2（GDH/HRP）作为互相拮抗的双AND门效应器（图7A-C）。葡萄糖（input A）作为双输入，一方面触发模块2中的一个AND门生成NADH荧光信号，另一方面激活模块1，产生H₂O₂并扩散至模块2的另一个AND门，将NADH氧化为NAD⁺，形成负反馈回路，诱导NADH荧光振荡（图7D-F）。进一步在模块1中封装过氧化氢酶（Catalase）可清除H₂O₂，从而使负反馈闭环电路转化为开环，导致NADH荧光持续输出（图7G-H）。
此外，作者将EELCs与人工细胞自毁机制耦合，构建自限性输出循环。模块1（inv/α-glu）作为发送OR门，在蔗糖（input A）/麦芽糖(input B)存在时释放葡萄糖信使，并由并联YES门构建的模块2接收。在葡萄糖的介导下，一个YES门（GOx/HRP；o-PD）产生2,3-DAP荧光输出，另一个YES门（Hex）催化ATP去磷酸化，诱导PDDA/ATP微滴解体，导致荧光信号消散（图8A-D）。得益于OR门，除（0,0）外，所有输入组合均可产生脉冲的荧光信号输出（图8E-F）。
图7. 具有负反馈与脉冲生成的EELCs
图8. 具有自限性输出循环的EELCs
结论
本研究利用声学图案化技术成功构建酶编码人工细胞阵列，实现了嵌入式酶逻辑门与电路的集成，可在单个人工细胞或群体水平执行分布式布尔逻辑运算，并动态调控持续性及瞬态信号输出。该系统兼具高度可编程性、环境适应性及低能耗特性，为开发智能微反应器与微型传感设备提供了创新技术方案。相较于微流控装置，声学技术以非接触式精准定位实现人工细胞群体的空间编程。相比自由溶液体系，该技术通过酶网络封装显著提升信号输出效率，并借助空间定位实现反应级联方向性控制，但其响应时间（数十分钟）受限于人工细胞高粘度导致的传质效率下降，未来需优化人工细胞的物化性质以优化信号响应时间。
撰稿：褚利康
校对：汪俊彦
编辑：江言
