Molecular Cell | G3BP1 在 RNA 缩合过程中促进分子间 RNA-RNA 相互作用

大家好！今天分享的是一篇于2024年12月发表在上Molecular Cell的一篇文章，题目是G3BP1 promotes intermolecular RNA-RNA interactions during RNA condensation，通讯作者是科罗拉多大学的Roy Parker 教授，其研究方向为神经科学和神经退行性疾病、核酸、癌症生物学。

研究背景

核糖核蛋白（RNP）颗粒是通过RNA和蛋白质组装的生物大分子凝聚体。应激颗粒是应激过程中非翻译信使核糖核蛋白颗粒（mRNPs）增加而形成的RNP颗粒。G3BP1和G3BP2蛋白通过RNPs的多价交联组装应力颗粒。作者证明G3BP1也具有“冷凝伴侣”功能，它促进应激颗粒的组装，但在初始冷凝后是必不可少的。在颗粒形成后，当RNA变性剂失活时，G3BP1对于颗粒的RNA成分在体外和细胞内的持续存在是必不可少的。这些结果表明，G3BP1作为一种“RNA凝聚器”发挥作用，这种蛋白质促进分子间RNA-RNA相互作用，稳定RNA凝聚，维持RNP颗粒持久性。

图文摘要

结果与讨论

1.G3BP1是体外RNA颗粒组装所必需但非持久的组分

为了测试G3BP1是否能够凝聚RNA，作者在体外组装了G3BP1和RNA的共凝聚体。向200 ng/ml的总人类RNA（hRNA）中加入重组GFP-G3BP1蛋白会导致G3BP1-RNA共凝聚体的形成。相比之下，单独的高浓度RNA或GFP-G3BP1不形成颗粒。这些观察结果与应激诱导的多聚体释放mRNAs以及随后由G3BP1促进的凝聚形成应激颗粒（SG）是一致的（图1A）。

为了测试G3BP1是否可以作为RNA凝聚剂，作者检测了G3BP1-RNA共凝聚物在蛋白酶K （PK）处理后的稳定性。即使在共凝聚物经过PK处理后降解了G3BP1，RNA组装仍然存在（图1B-1E）。相比之下， G3BP1在与RNA混合前先用PK预处理，可以防止凝聚物的形成，说明蛋白酶处理足以降解G3BP1的凝聚功能。

2.MEG-3是体外RNA凝聚物组装所必需但非持久的组分

为了检验是否其他RNP颗粒蛋白“支架”只需要体外初始RNA和蛋白质共凝聚，作者检测了RNA与MEG-3蛋白的组装。通过体外将MEG-3与RNA共凝聚和随后的PK处理，确定了MEG-3也能够促进稳定RNA组装的形成（图1F和1G）。MEG-3在体外形成稳定RNA组件的能力表明，RNA聚集器活性不是G3BP1所独有的，可能是RNP颗粒成核因子的保守特征。

图1. RNA颗粒在G3BP1降解后仍然存在

3.RNA在PK处理的体外凝聚物中的持久性需要时间

RNA从动态状态重新排列到凝聚体内部的稳定网络，被称为动态停滞，预计需要一定的时间。为证明该假设，作者研究了RNA组装对PK处理产生抗性的时间过程（图2）。观察到，与GFP-G3BP1或未标记的G3BP1形成的共凝聚物在PK处理前经过一段时间的老化后，再经PK处理后保留了更多的RNA含量。这是因为随着时间的推移，稳定的RNA网络可能需要碱基配对相互作用或其他分子间RNA-RNA相互作用的能力。当使用10 mM Mg²⁺与Poly-A/C/G/U形成共凝聚体时，仅Poly-G RNA组装体在PK处理后存在。这表明分子间相互作用，包括碱基对，在维持蛋白酶处理的RNA颗粒中起着作用。

图2. G3BP1降解后RNA凝聚物的持久性需要时间

4. G3BP1降解后RNA凝聚物的持久性需要分子间RNA-RNA相互作用

该模型预测，在G3BP1降解后，通过削弱RNA-RNA相互作用而不是蛋白质-蛋白质或蛋白质-RNA相互作用的处理，PK处理的RNA颗粒应该对变性敏感。鉴于此，作者测试了PK处理的体外共凝聚物对RNA或蛋白质变性剂的敏感性。观察到一些RNA变性剂几乎完全溶解了PK处理的体外共凝聚物（图3A、3C）。PK处理的体外共凝聚物在50 mM EDTA中完全溶解，这表明RNA-RNA相互作用是G3BP1缺失后RNA颗粒稳定性的基础。

图3. PK处理的RNA颗粒含有稳定的RNA-RNA相互作用

作者认为，如果RNA-RNA相互作用显著地促进了RNA颗粒结构，RNA特异性交联应该使PK处理的体外共凝聚物可以抵抗RNA变性剂的处理。在共凝反应中加入4′AMT使RNA共价交联，发现无论是否暴露于紫外线处理下，都不会影响共凝物或pk处理的体外共凝物（图3B、3D），进一步表明RNA-RNA相互作用在共凝聚物形成中发挥重要作用。

5. PK处理的体外共凝聚物中的RNA网络由稳定的高阶结构组成

G3BP1降解后RNA组装的持久性表明形成了RNA分子间相互作用的网络。此外，这些RNA-RNA相互作用可以通过4′AMT交联共价连接并显示出高阶组装。作者使用荧光标记的体外转录的荧光素酶和cycB RNA，观察到仅含有这两种RNA的凝聚物在PK处理后得以维持，通过EDTA溶解，并通过4′AMT交联稳定化（图4A）。通过检测在聚乙二醇（PEG）和高盐的条件下形成的不含G3BP1的RNA组装体，测试了4′AMT交联如何影响凝聚物中RNA的迁移。在PEG条件下，4′AMT交联的RNA有少部分RNA留在孔中（图4B），表明形成了高阶的RNA组装体。

图4. PK处理的RNA颗粒是高阶结构

6. SGs在G3BP1功能破坏后仍能在细胞中持续存在

G3BP1凝聚使得在SGs内形成新的RNA-RNA相互作用，那么在G3BP1失活后，定位于SGs的RNA仍会存在。作者通过使用G3BP抑制剂a （G3Ia）处理细胞来验证这一预测。当细胞同时被ATP耗尽和G3Ia处理时，即使G3BP1不再具有支架功能，SGs仍然存在（图5A），并且在极少数细胞中观察到NORAD和dT染色的RNA组装体没有G3BP1信号。这表明，一旦SGs形成，在ATP耗尽时，G3BP1对于RNA颗粒的持续存在并不是必需的。作者用PBSTween渗透细胞，然后加入PK，导致表达GFP-G3BP1的U2OS细胞中GFP信号完全丧失，然而观察到Poly-A RNA和NORAD并未发生分散，且PK处理前后颗粒中的NORAD RNA水平保持一致（图5C-D）。

图5. G3BP降解后，应激颗粒rna在体内持续存在

7.核仁的RNA成分在PK处理后仍保持组装

SG蛋白在细胞中丢失后，SGs RNA组分的持续存在，使作者考虑其他RNP组装体是否也可以形成稳定的RNA网络。作者检测了经过PK处理的细胞中核仁RNA和蛋白标记物。结果表明，核仁的47s50’外部转录间隔区RNA组分在核仁蛋白降解后仍然存在。snoRD3A在PK处理后失去了大部分核仁富集（图6）。snoRD3A的分散表明，snoRNAs这样的高度结构化RNA可能没有足够的区域在RNA组装中形成稳定的分子间相互作用，而是需要蛋白质定向的招募和保留。结合SG蛋白降解后SGs的RNA成分仍然存在的发现，表明蛋白质导向的RNA凝聚形成稳定的RNA网络可能是RNP细胞器的共同特征。