Nat. Commun | DNA 修饰酶驱动的合成分子开关

大家好，今天给大家分享的是2024年5月发表在nature communications上的“Synthetic molecular switches driven by DNA-modifying enzymes”。

通讯作者：

魏迪明，清华大学生命科学学院副教授。他的研究方向为DNA纳米科技及其在材料科学与生命科学方面的应用。以第一/通讯作者在Nature、Nature Communications、Science Advances、JACS、Angew. Chem.、ACS Nano等期刊上发表论文20余篇。

研究背景：

自然界中的分子开关，如蛋白质磷酸化/去磷酸化机制，这些分子开关调控机制启发了作者设计核酸纳米结构的分子开关。在过去，核酸分子作为遗传物质被研究的同时，也作为一种分子材料用于构建纳米到微米尺寸的非天然大分子结构以及对其进行动态调控。经过设计的核酸纳米结构可以用于药物递送，分子计算，生物机器人等生物研究和应用。对核酸纳米结构的动态调控使其具有更丰富的功能和应用，尤其是与酶合作进行的调控，使核酸分子工具箱具有更多的应用可能性。为了解决酶促反应介导核酸纳米结构动态变换中的非特异性反应导致的脱靶效应，本文作者对核酸序列进行了巧妙地设计，在特定的反应环境下，酶只能对工作位点进行处理，保留了非工作位点维持结构完整性的需求。

Results：

酶驱动分子开关的设计

在该分子系统中，酶作为调节器，用于将DNA纳米结构在开启和关闭状态之间切换。为了满足控制正向和反向反应的开关设计，该研究选择了具有特殊特性的DNA聚合酶（Bsu DNAP）和缺口内切酶（Nt.AlwI）。Bsu DNAP能在存在特定dNTP（dTTP、dCTP、dGTP）的条件下精确延伸DNA链，而TpT屏障设计阻止了非工作位点的扩展。Nt.AlwI通过识别特定位点生成粘性末端，同时保持高特异性以减少脱靶效应。同时，在M13 DNA折纸实验中，3′末端附加TpT尾部保护折叠结构的完整性。由于Bsu DNAP无外切酶活性，这些尾部不会影响结构稳定性和反应精准性，从而确保纳米结构的完整性。

图1 两种分子开关的反应示意图

X型分子开关：

接下来，作者在DNA纳米结构中实现了两种分子开关（X型和Y型），并通过特定的工作位点控制它们在ON和OFF状态之间的切换。研究首先在一个极简系统中实现了X型开关（图2a）。X型开关由两个T结（XI和XII）和一对16-bp的粘性末端连接组成。在正向反应（FX）中，Bsu DNAP在37°C下延伸XI模板，置换了原始的粘性末端，从而将复合物X分解为XI和XII，进入OFF状态。接着，在反向反应（BX）中，Nt.AlwI切割新延伸的片段，并与XII的粘性末端竞争，促使XI和XII重新结合，恢复为完整的复合物X（ON状态）。此反应通过控制温度（37°C处理后为解耦，40°C下进行重组）确保了高效的结构转换。

图2 DNA纳米结构中分子开关的实现

实验结果通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了酶反应的有效性。由于正向和反向反应分别由不同的酶驱动，研究发现去除前一反应中的残留酶对于推动后续反应至关重要，这有助于实现多轮的可逆反应。虽然未进行彻底的酶失活或去除，但实验中证明了这一机制的可行性。

随后，作者将X型开关应用于一个5×5晶格结构中，其中使用10-nt的粘性末端将四臂连接基序连接（图2c）。在Bsu DNAP的处理下，完整的5×5晶格（X）被分解为3×5晶格（XI）和2×5晶格（XII），凝胶结果显示为正向反应的主要条带（图2c，lane FX）。两个晶格在Nt.AlwI的处理下重新耦合成完整的晶格（lane BX）。AFM成像结果进一步验证了反应产物与预期形态一致。

类似地，Y型开关也在基于T结和5×5晶格的系统中得到了验证（图2d）。Y型开关的工作位点设计为单对结合系统（图2e）。在Y型5×5晶格中（图2f），Nt.AlwI切割导致完整的晶格（Y）解离为3×5 YI和2×5 YII，凝胶结果显示为正向反应的主要条带（lane FY）。然后，Bsu DNAP重新打开发夹环，促使YI和YII在反向反应（BY）中重新耦合成完整的晶格Y，凝胶结果显示为lane BY。AFM分析进一步证明了在ON和OFF状态之间的有效切换。

图3 ×8格体系中的一步剪切和粘贴操作

为证明同一酶在不同分子开关中的多样活性，作者在一轮反应中同时实现了结合和解离操作。实验首先在具有14bp粘性末端的8×8晶格上分别执行“剪切”和“粘贴”操作以验证功能。在反应FX中，8个切割位点被安排在晶格内部，Bsu DNAP通过模板延伸取代原始粘性末端，将8×8晶格分解为一个C形晶格和一个2×3晶格（图3a）。AFM结果验证了设计的正确性。在反应BY中，外部结合位点被设计在两个8×8晶格的粘贴位置上（图3b）。Bsu DNAP打开发夹生成粘性末端，使两个8×8晶格通过粘性末端内聚完成耦合。

在单独验证剪切和粘贴功能后，作者设计了包含切割位点和粘贴位点的复合作业（图3c）。两个8×8晶格分别具有8个切割位点和6个粘贴位点，经过Bsu DNAP处理后，两个晶格被切割为C形结构，并通过粘贴位点耦合为一个0形复合体。此外，通过调整切割位点位置，可以在晶格上雕刻出不同的形状和数字（如数字1-9，图3d）。这些设计为更复杂的操作奠定了基础。进一步地，研究者建议使用Cas9代替切口内切酶，以实现更灵活的切割操作，不再依赖预定义的工作位点，从而扩大技术应用范围。这一系列操作展现了DNA纳米结构的多功能性和复杂性，为动态调控和高阶设计提供了新思路。

图4 折纸方格系统中复杂的一步剪切和粘贴操作

作者利用精心设计的DNA折纸方块演示了在一步操作中实现剪切和粘贴的能力。由于M13折纸支架不支持定制的三字母编码，研究者引入了保护性TpT尾部以确保专用处理。具体来说，每个普通主链的3′端附加一个TpT尾巴，Bsu DNAP因缺乏外切酶活性无法消化该悬垂部分，从而阻止了不希望的链延伸以保持结构的完整性。同时，为使用用户指定序列的12bp粘端组合折纸单元，设计了TpT屏障以避免非特异性延伸。

在第一个例子中（图4a），起始的I型三聚体由三个串联单元组成，经过酶处理后被转化为L型三聚体。剪切位点设计在II单元东侧和III单元西侧，粘贴位点设计在II单元南侧和III单元南侧。Bsu DNAP处理后，III单元从II单元的东侧分离，并重新附着在其南侧。最终，AFM结果显示三聚体的形状由I型成功转化为L型。在第二个例子中，加入一个新折纸单元IV后，起始的I型三聚体（I-II-III）和IV单体通过粘贴位点（YI与YIV）在酶处理后成功转化为O型四聚体。作为对照，若II单元和III单元没有切割位点，则IV单元附着形成L型四聚体，而II单元保持不变。AFM成像结果（图4b）进一步验证了这些操作的可行性。研究表明，这种剪切和粘贴方法可在更复杂的DNA纳米结构设计中应用。

Conclusion：

该工作提出了一种利用酶可控地开关DNA分子结构粘性末端连接的分子系统。通过特定酶处理，该工作展示了合成DNA纳米结构的组装/解离行为。这种酶处理作为DNA纳米结构的设计手段，是基于DNA链置换的有益补充。与DNA链置换系统相比，该工作的酶介导系统具有更高的反应产率和速率，且组件更简单、不依赖化学计量。该分子开关直接控制粘性末端的暴露或阻断，引发对应结构组装或解离。在设计中，功能序列作为检查点确保所需的反应途径，同时减少副反应。从自然中获得启示，设计更高效的反应级联，带有多层次的调节组分是可取的。酶处理可实现更具针对性和高效性的开关，而终止特定酶活性或去除酶则有助于防止非特异性反应。

微信号：HanDa-Lab

课题组网站：https://www.hanlab.net/