JACS | 用于活细胞代谢物成像的基因编码荧光DNA适体

大家好！今天为大家分享一篇发表于 JACS （2024年12月）的研究论文，题为 “Genetically Encoded Fluorogenic DNA Aptamers for Imaging Metabolite in Living Cells”。论文由德克萨斯大学奥斯汀分校化学系陆艺教授团队完成，其研究聚焦于生物合成无机化学、DNA酶与核酸适体（Aptamer）传感器及成像技术，以及功能性DNA纳米技术等方向。本研究通过基因编码的荧光适体实现了代谢物在活细胞中的成像，为代谢物动态监测提供了全新工具。

研究背景

基因编码的荧光蛋白和荧光RNA传感器是活细胞中生物分子成像的重要工具。然而，荧光蛋白传感器因靶标范围有限、设计复杂性高，而荧光RNA传感器又因稳定性不足，应用受到了限制。相比之下，荧光DNA传感器具有更广的检测范围和更高的稳定性，展现出巨大潜力。然而，目前用于活细胞成像的荧光DNA传感器大多需要预标记荧光团，这种依赖预标记的方法在活细胞中会因细胞分裂导致DNA适配体浓度逐渐降低，从而限制其实时监测能力。

结果与讨论

1.基于DIRFA的分裂适体（DASA）传感器的开发和表征

图 1基于DIRFA的分离适体(DASA)传感器的设计与表征

首先，作者通过体外实验评估了 dimethylindole red (DIR) specific Fluorogenic DNA Aptamer (DIRFA) 在活细胞中应用的潜力，并利用截断分析探究了 DIRFA 的茎区 Stem D1 的功能（图1A）。结果表明，相较于标准 DIRFA，削减超过3个碱基对会导致荧光强度下降达80%（图1B-C）。基于此，作者推测茎 D1 在荧光信号开启中起关键作用，并可能在结合靶适体开发小分子传感器时充当信号转导区域。

为验证这一假设，作者以 ATP Aptamer 作为模型（图1D）。在无 ATP 的情况下，茎 D1 结构被破坏；而 ATP 的结合则使该区域稳定，从而恢复了 DIRFA 的荧光性能。这一设计被命名为基于 DIRFA 的分体适配体 (DASA) 传感器。在 ATP Aptamer 或 DIRFA 结构中引入点突变后，观察到荧光信号显著减弱（图1E-F），进一步验证了 DASA 传感器的有效性。最终实验结果表明，该传感器能够成功检测溶液中的 ATP。

2.DASA传感器的二聚化

图 2二聚体DASA（dDASA）传感器的设计与表征

为了优化 DASA 传感器的活细胞应用性能，作者通过二聚化设计（dDASA），提升了传感器的稳定性、结合亲和力和亮度（图 2A）。为评估单体间链节长度对传感器性能的影响，作者分别测试了 4 nt、8 nt、10 nt 和 13 nt 接头。结果表明，具有 10 nt 接头的 dDASA 2-C 在检测 PBS 缓冲液中 ATP 时，不论在高温还是低温条件下，都表现出较强的荧光信号及显著的荧光增强效果（图 2B-C）。因此，后续实验均选用dDASA 2-C。

进一步测试显示，dDASA 2-C 在两种温度条件下均具有较宽的 ATP 检测范围（图 2D-E），并对其他 rNTP 分子表现出良好的选择性（图 2F-G）。这表明 dDASA 的改进设计显著增强了传感器在多样环境下的检测性能，为其在活细胞成像中的应用奠定了基础。

3.活细胞ATP感知的时间控制

图 3使用DIRFA评估HeLa细胞中DIR的细胞膜通透性

作者将 DIRFA 转染至缺乏 DIR 的 HeLa 细胞中，并在转染后向培养基中添加 DIR，测量荧光强度随时间的变化（图 3A）。结果显示，荧光强度随时间逐渐增加，并在 20 分钟后达到稳定状态。为进行比较，作者还共转染了与前述实验中相同量的DIRFA 和 DIR（图 3B）。结果表明，共转染产生的荧光强度与转染后仅 4 分钟添加 DIR 所观察到的荧光强度相当（图 3C）。这表明，转染后快速添加 DIR 可实现与共转染类似的荧光响应效果。

4.活细胞中的实时ATP跟踪

图 4使用dDASA传感器实时跟踪HeLa细胞中的ATP

为了评估dDASA传感器是否可以实时监测活细胞中的ATP水平，作者将dDASA传感器递送到HeLa细胞中后，交替改变葡萄糖的浓度。在高葡萄糖培养基（添加25 mM葡萄糖）中培养的细胞中观察到较高的荧光信号，在暴露于无葡萄糖培养基的细胞中观察到降低的信号（图4A, C）。为了进一步验证这些观察结果，作者通过用Oligomycin和CaCl₂交替处理细胞来监测ATP水平。Oligomycin处理后观察到荧光降低，而CaCl₂处理后荧光增加（图4B, D）。这些结果证实dDASA可以可逆地实时跟踪ATP水平。

5. 基因的编码荧光DNA适体(GEFDA)传感器用于细菌细胞中ATP检测

图 5基因的编码荧光DNA适体(GEFDA)传感器用于细菌细胞中ATP检测

为了提高 DNA 的产量，作者构建了高拷贝质粒，通过逆转录酶（RT）与 GEFDA mRNA 上的 tRNA 结合位点相互作用，启动对 GEFDA 的逆转录过程。在 β蛋白和传感器串联重复结构的协同作用下，质粒在细胞中实现了更高效的 GEFDA 产量（图 5A）。作者随后将该质粒转化至DH10B 感受态细胞中以表达DIRFA 或 dDIRFA。流式细胞术表明，在接收 dDIRFA 质粒的 DH10B 细胞中，超过 40% 的细胞荧光强度高于 10³，而未转化的对照组几乎无荧光信号（图 5B-C）。

为了评估 dDASA 传感器作为 GEFDA 传感器的检测能力，作者将转染了质粒的细菌分为三组，并分别与普通培养基、补充 ATP 的培养基及含有 ATP 合酶复合物抑制剂（VentA）的培养基共同孵育。随后，细菌与 DIR 一起孵育，并通过流式细胞术测量荧光信号。结果表明，在使用 IPTG 诱导后，荧光强度显著增加，在表达 dDASA 的细菌中成功检测到了细胞内的内源性 ATP 水平。此外，与 ATP 孵育进一步增强了荧光信号，而 VentA 处理则导致显著下降（图 5D, F）。

在普通培养基条件下，细菌中出现了两个亚群，说明传感器能够以单细胞分辨率区分亚群内的差异。进一步分析显示，将点突变引入 dDASA 的 ATP 结合位点后，荧光信号变化显著减弱，证实了传感器的信号变化是响应于 dDASA 对 ATP 的特异性识别和结合。这些结果表明，dDASA 质粒能够有效检测细胞内ATP 水平，并支持其作为灵敏的传感工具（图 5E, F）。

6.GEFDA传感器用于监测哺乳动物细胞中ATP

图 6 GEFDA传感器用于监测哺乳动物细胞中ATP

为了验证 GEFDA-dDASA 传感器是否能够实时追踪活细胞内 ATP 的动态变化，作者通过荧光信号监测同一细胞群在不同条件下的 ATP 水平变化。实验中，分别使用葡萄糖、Oligomycin 和 CaCl₂ 来调节细胞内的 ATP 水平。结果显示，在葡萄糖孵育过程中，荧光信号逐渐增加，表明传感器能够有效检测单细胞内 ATP 水平升高（图 6A, C）。加入 Oligomycin 后，荧光信号先短暂升高，随后显著下降，这与 Oligomycin 诱导代偿性糖酵解的已知效应一致。进一步用 CaCl₂替代 Oligomycin，荧光信号逐渐恢复，表明 Oligomycin 对 ATP 酶的抑制是可逆的（图 6B, D）。这些结果证明，GEFDA-dDASA传感器可以灵敏地检测和动态监测活细胞内的 ATP 水平变化，为研究细胞代谢活动提供了重要工具。